尼古丁是烟草植物中主要的生物碱,它很容易穿过血脑屏障和生物膜与神经系统中的烟碱乙酰胆碱受体相互作用,引起恶心、心律失常、痉挛等,对人体造成伤害;同时,在卷烟制造过程中产生的大量烟草废弃物会污染水源、土壤,带来严重的环境问题。在研究中发现有些微生物可以利用尼古丁作为碳源和氮源来供给自身生长,利用微生物降解尼古丁可以降低香烟中的尼古丁含量,从而减少吸烟者对烟草的成瘾性;还可以应用于工业生产中烟草废弃物中的尼古丁的降解,以缓解由其所引起的生态污染问题。因此,研究微生物对尼古丁的代谢作用具有显著的科学意义和重要的应用价值。尼古丁细菌代谢途径主要有两种,一种是节杆菌属的吡啶途径,另一种是假单胞菌属的吡咯途径。目前,已报道了几种有尼古丁降解能力的真菌,但只报道了尼古丁降解第一步反应是从尼古丁吡咯烷脱甲基生成去甲基尼古丁,且相关酶学机制并未阐明。基于尼古丁中间代谢产物的分离和鉴定,本实验室首先在国际上提出了一条新的米曲霉尼古丁降解途径,首次较为详细的阐释了尼古丁真菌降解途径,但这条途径的降解酶及其编码基因目前均未阐明。CRISPR/Cas9系统日渐发展成为一种成熟的基因编辑技术,该系统可以通过非同源末端连接或同源重组的方式实现基因编辑,还可以通过共转化不同靶标的sgRNA和供体DNA（dDNA）同时实现多个靶基因的敲除,因此,本论文旨在通过构建CRISPR/Cas9系统,针对真菌中首次报道的米曲霉尼古丁完整代谢途径中相关候选基因进行研究。我们前期通过Western blot和绿色荧光蛋白表达检测到了 Cas9蛋白的表达,但建立的CRISPR/Cas9系统能否真正地用于米曲霉靶向基因编辑还未可知。pyrG基因控制表达尿嘧啶核苷酸合成的关键酶,本论文针对米曲霉pyrG基因设计靶向sgRNA,第一次验证了在米曲霉建立的CRISPR/Cas9系统的活性,成功筛选到了米曲霉营养缺陷型突变株,突变株需要外源添加尿苷、尿嘧啶才能正常生长。本论文首次在米曲霉菌株利用CRISPR/Cas9实现了基因编辑,这为下一步利用CRISPR/Cas9系统敲除米曲霉尼古丁代谢相关候选基因的研究做好了准备。根据米曲霉尼古丁去甲基酶肽谱分析和尼古丁诱导的米曲霉转录组分析结果,筛选到了三个可能与米曲霉尼古丁代谢相关的候选基因:cyp577a4（cyp1）基因、cyp620h2基因和xdh基因。其中cyp577a4（cyp1）在两次转录组分析中转录差异水平上调最高,且CYP577A4（CYP1）与米曲霉CYP库的肽谱匹配率为10%,此前推断其最有可能与尼古丁真菌代谢途径中第一步脱甲基有关;将有尼古丁去甲基活性的烟草CYP82E4和人体CYP2A6与米曲霉CYP库进行氨基酸序列比对,发现与米曲霉CYP620亚家族有着较高的序列相似性,且cyp620h2基因在两次转录组分析中都有上调,其也很有可能是催化尼古丁脱甲基的基因;xdh基因也是本实验推测的与尼古丁代谢相关的基因,编码一种N-甲基烟酰胺α-羟基化的钼喋呤羟化酶,可能与尼古丁中间产物N-甲基烟酰胺的代谢有关。针对三个候选基因设计靶向sgRNA,并构建靶向目的基因的同源修复供体,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术敲除米曲霉尼古丁代谢相关候选基因,以揭示其功能。本论文成功利用CRISPR/Cas9介导的同源重组敲除了米曲霉cyp577a4（cyp1）基因,并通过TLC检测尼古丁降解反应,证明了cyp577a4（cyp1）基因与米曲霉尼古丁代谢不直接相关。此外,本论文还尝试利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术敲除米曲霉cyp620h2基因和xdh基因,虽然筛选到了吡啶硫胺素抗性菌株,但发生了脱靶效应,未成功实现靶基因敲除。本论文工作为以后研究尼古丁真菌代谢途径提供了一个新的工具,为利用在米曲霉中构建的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除候选基因,从而发现与尼古丁降解相关的基因,进而通过基因的外源表达等进一步研究,阐释真菌尼古丁降解的酶学及分子生物学机制奠定了坚实的基础。