表观遗传(epigenetic inheritance)是指在不通过传统的“中心法则”中DNA复制、RNA转录翻译、蛋白质表达的方式来改变遗传性状,而是在不改变遗传物质的情况下直接改变遗传性状且具有遗传特性的生物学现象。目前表观遗传主要是通过对DNA修饰、组蛋白翻译后修饰和非编码RNA的调控等方式进行,研究发现其与多种疾病相关。近年来,表观遗传类蛋白(epigenetic protein)逐渐成为了新的一类潜在的药物作用靶标,在药物研发中受到越来越多的关注。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)是研究较多的溴结构域和超末端结构蛋白(bromodomain and extra-terminal,BET)家族成员,是实体瘤、白血病及纤维化等疾病药物设计和发现的热点靶标。到目前为止,已有多种类型的BRD4抑制剂进入了临床研究阶段,但仅有Fedratinib一种抑制剂成功上市,因此发现新颖结构的BRD4抑制剂仍然具有非常重要的意义。BRD4作为表观遗传家族蛋白的一员,因其在行使生物功能时主要以蛋白-蛋白相互作用(proteinprotein interaction,PPI)为主,因此其抑制剂的作用位点位于PPI表面,这为药物发现与设计带来了挑战。本论文以计算机辅助药物设计(computer-aided drug design,CADD)技术为手段,从评估分子对接方法对表观遗传蛋白的适用性、筛选结构新颖的小分子抑制剂、探索苗头化合物的作用机制等角度着手,层层推进BRD4抑制剂的研究。本论文主要包含了以下几个方面的工作:1.系统评测了AutoDock、AutoDock Vina、FITTED、LeDock、UCSF DOCK、Gold、Glide、LigandFit和Surflex Dock等9种分子对接方法对表观遗传家族蛋白的预测能力。结果表明,上述方法对表观遗传家族蛋白抑制剂的结合构象、结合能力以及活性分子筛选能力的预测均不理想,在评测的方法中,Gold的表现相对较好,在最接近实际情形的配体优化后含结晶水/无结晶水最佳打分的情况下,对接成功率达到了38.83%和25.24%,而AutoDock Vina和LeDock软件虽然在含结晶水时对接成功率分别为41.75%和42.72%,但在无结晶水时对接成功率仅14.56%,这说明结晶水分子对抑制剂的结合具有非常重要的意义,考虑结晶水分子对于抑制剂结合构象的准确预测至关重要。而在对接打分能力上,Gold、AutoDock和AutoDock Vina表现相对较优,但各方法的皮尔森相关系数均不理想,这也表明各打分函数对表观遗传蛋白家族的适用性较差。2.系统研究了BRD4活性位点中的结晶水网络对抑制剂结合的重要性,并采用基于结晶水网络的分子对接技术对Specs化合物数据库进行了虚拟筛选和活性评价,成功发现多个结构新颖、活性较好的苗头化合物。分子动力学模拟和MM-GBSA结合自由能预测结果表明,化合物3和31具有多个低能构象空间,仍有着较大的改造余地。改善化合物3在WPF口袋内的取代基团并适当增加与ZA channel的相互作用,以及缩短化合物31在ZA channel方向中的基团结构并增加其与WPF口袋的相互作用都是结构优化的可行方向。3.采用配体分子的标准化处理流程与基于结晶水网络的分子对接技术对ChemDiv数据库进行了虚拟筛选,活性评价结果表明该策略有效提高了虚拟筛选的预测精度,其中5个苗头化合物具有新颖的骨架结构。对苗头化合物17的类似物进行了活性评价和构效关系分析。结果表明,BRD4-BD1对linker的长度有着较高的敏感度,这是由于蛋白质自身的口袋特点决定了化合物必须呈现“L”形构象,进而使其在与天冬酰胺Asn140形成关键氢键的同时亦能作用于WPF口袋。因此,对于苗头化合物17的改造,寻找合适的linker对于提高活性是非常关键的;对于伸入WPF口袋的R-group区域,苯环上的取代基团吸电子效应越强越利于提升化合物的活性;而过多的取代基则会导致活性下降,这可能是由其位阻效应决定的,应当尽量避免同时在苯环上一侧的邻位和间位同时引入取代基。4.通过常规分子动力学模拟技术和伞形采样(umbrella sampling,US)技术将苗头化合物17与进入临床阶段的抑制剂I-BET-762进行了对比,分析了它们在结合自由能、结合模式、结合/解离过程等方面的差异。结果表明,酪氨酸Tyr139方向和ZA channel方向是苗头化合物17进一步优化的关注点,WPF口袋和氨基酸残基Tyr139、Asn140在MM-GBSA结合自由能上的差异表明了它们是结合作用中重要的氨基酸残基,而Leu92和Leu94则很有可能在结合作用中起到了相反的作用。此外,抑制剂I-BET-762的乙基酰胺基团与Asn140的酰胺基团O原子形成的氢键作用是引起其体系发生ZA loop外推而打开结合口袋的重要因素,引入类似的作用方式很有可能给苗头化合物的活性带来质的提升。两个抑制剂在解离过程中表现的比对发现,Asn140的氢键相互作用的强弱和多寡直接影响结合能力,这说明在后续的改造苗头化合物过程中适当的增加配体分子的氢键供体和受体数目对于活性能力的提高是有益的。