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研究背景与意义凝血因子Ⅷ(FⅧ)主要参与血液凝固与止血过程。在血液循环过程中FⅧ与von Willebrand factor(vWF)蛋白相结合,当两者分离,FⅧ活化后便会协助活化的凝血因子Ⅸ激活凝血因子X,稳定生理性止血。FⅧ基因(F8)位于X染色体长臂末端,当其基因发生缺陷时便可使FⅧ活性表达下降,从而导致A型血友病的发生;当其活性升高时,便又易引发血栓的形成。因此F8表达调控研究对于阐明FⅧ在生理性止血与凝血障碍疾病形成过程中有着重要作用。2016年一项研究通过微阵列和单细胞RNA-seq技术,确定FⅧ是由特定的血管内皮细胞和淋巴血管内皮细胞合成,但其具体的分子调控机制却并不清楚。本文通过对F8基因进行系统发育分析,在第一内含子中鉴定出一段长约500bp的保守序列。该序列刚好与表达FⅧ的内皮细胞所特有的DNase超敏感序列(DNase-hypersensitive sequences,DHS)相重叠,提示该区域可能在F8转录过程中发挥一定作用。后续通过一系列体外生化实验和体内基因敲除实验,相继证明该片段在F8转录过程中发挥内皮细胞特异性增强子作用。本文揭示了新的F8基因表达调控机制,补充了 FⅧ生物学基础知识,对解决临床凝血问题具有重要理论指导意义。研究目的本研究旨在探讨特定内皮细胞中F8基因转录调控机制。研究方法1.F8基因组序列研究在UCSC基因组浏览器中查询多种哺乳动物F8基因组序列,并运用Bio Edit软件进行序列对比,结合Encode数据库探索保守序列处存在的DNA调控元件,并分析其功能。2.DNase超敏感序列对荧光素酶表达的影响通过体外扩增DNase超敏感序列,并将其以正向和反向的方式分别插入到荧光素酶报告基因启动子上游,以构建完整的荧光素酶报告基因系统质粒。然后运用脂质体转染的方式将其转染到细胞中,48h后收集细胞并检测荧光素酶活性。3.DNase超敏感序列对细胞中用mRNA表达的影响同步培养DHS-KO-bEnd3细胞与bEnd3细胞,待其汇合度达90%后收取细胞进行RNA提取,并通过实时荧光定量PCR技术检测不同细胞中F8mRNA的表达。4.DNase超敏感序列对细胞中FⅧ:C活性的影响同步培养相同数目DHS-KO-bEnd3细胞与bEnd3细胞,保证其增殖速度相同的情况下同时收取细胞上清,通过FⅧ:C活性检测试剂盒进行活性检测。5.DNase超敏感序列对小鼠组织中F8 mRNA表达的影响分离WT与DHS-KO雄性小鼠体内肝脏,脾脏,肾脏,肺,淋巴结,匀浆破碎后进行RNA提取,并通过实时荧光定量PCR技术检测不同组织中F8 mRNA的表达差异。6.DNase超敏感序列对小鼠血浆FⅧ:C活性的影响分别抽取WT与DHS-KO雄性小鼠体内下腔静脉血液,过程中采用3.8%二水合柠檬酸三钠抗凝,离心获取上层血浆后,用FⅧ:C活性检测试剂盒检测不同基因型小鼠血浆中FⅧ:C活性差异。研究结果1.DNase超敏感序列的发现我们在F8基因第一大内含子中发现一段509bp的相对保守序列,该序列中含有多个转录因子结合位点,包括GATA box,E-box-GATA混合基序与MEF2等,同时该段序列还与FⅧ表达细胞中高度活跃的DNase超敏感序列相重合,提示该序列可能与8内皮细胞特异性转录有关。2.DNase超敏感序列可以增强下游基因的表达我们通过构建荧光素酶报告基因系统发现,当把含DNase超敏感序列的荧光素酶报告基因质粒转染到表达FⅧ的细胞中时,DNase超敏感序列明显增强荧光素酶的表达,提示DHS可能具有类似增强子的作用,能够促进下游基因的表达。3.DNase超敏感序列敲除后显著降低细胞中F8 mRNA的表达对bEnd3细胞与DHS-KO bEnd3细胞中F8 mRNA进行定量检测,结果发现DNase超敏感序列敲除后明显降低F8 mRNA水平表达(P<0.0001),提示DHS会影响F8基因的转录。4.DNase超敏感序列敲除后显著降低细胞中FⅧ:C活性收集bEnd3细胞与DHS-KO bEnd3细胞培养基上清进行活性检测发现,当DNase超敏感序列敲除后,FⅧ:C活性明显降低(P<0.0001)。5.DNase超敏感序列敲除后显著降低小鼠组织中F8 mRNA表达取WT鼠与DHS序列敲除鼠中肝脏,肾脏,脾脏,肺,淋巴结,组织破碎裂解后提取RNA,进行实时荧光定量PCR检测,结果发现敲除鼠各组织中F8 mRNA表达明显降低,尤其肝脏(P<0.001),淋巴结(P<0.0001)中则更为显著。6.DNase超敏感序列敲除后显著降低小鼠血浆FⅧ:C活性取WT鼠与DNase超敏感序列敲除鼠血浆,进行活性检测,结果发现,当DHS序列敲除后血浆中FⅧ:C活性显著降低(P<0.05),提示即使在复杂的体内环境中,DHS序列仍会影响F8表达。结论(1)F8中DNase超敏感序列具有内皮细胞特异性增强子作用,能够显著增强下游基因的表达;(2)DNase超敏感序列敲除后能显著降低细胞中F8mRNA表达与FⅧ:C活性;(3)在小鼠体内敲除DNase超敏感序列后,能显著降低组织中F8 mRNA表达与血浆FⅧ:C活性。