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研究背景:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类具有细胞遗传学和分子异常的高度侵袭性恶性肿瘤。其特征在于造血干细胞的分化障碍、骨髓和外周血中原始细胞克隆性扩增。在过去的几十年,已有多种疗法被应用于AML的治疗,例如标准的“7+3”诱导疗法,由7天的阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)与3天蒽环类药物组合DA方案可以有效的杀死AML中的白血病细胞,但绝大多数AML患者在3年内出现致死性的疾病复发,患者5年总生存率(overall survival,OS)低于40%。目前治疗AML面临的最大挑战之一是常规治疗方案无法杀死阻抑凋亡的快速增殖的肿瘤细胞。本研究在于阐明AML细胞维持快速增殖能力和耐药性的分子机制,为开发更安全、有效的治疗AML的疗法提供理论基础。转录是所有活细胞所必需的“重要过程”。肿瘤细胞需要高水平的转录过程来维持快速增殖和存活,并且转录失调在肿瘤细胞中是普遍发生的。例如,RNA聚合酶I(RNA polymerase I,RNAPI)转录失控,出现转录过度活跃被认为是血液肿瘤细胞存活必需的,并且可以在体内进行针对性靶向治疗。与正常细胞相比,肿瘤细胞中RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase Ⅲ,RNAPⅢ)转录活性增加。POLR2A是编码RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,RNAPⅡ)最大亚基RPB1的基因,与RNAPI和RNAP Ⅲ在肿瘤细胞中表达过度活跃不同,尽管POLR2A被认为是转录致癌基因和抗凋亡基因从而维持肿瘤细胞的快速增殖过程所必需的,既往关于POLR2A在肿瘤中研究有在结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌组织中出现杂合性丢失、在脑膜瘤的不同子集中的出现了 POLR2A基因突变。然而RPB1在急性髓系白血病中的表达情况及相关机制研究尚未见报道。研究目的:1.分析RPB1及其编码基因POLR2A在AML原代样本、细胞株和正常人外周血对照样本中的表达情况,并分析RPB1的表达与AML临床特征的关系。2.探讨RPB1在加速AML疾病发生过程中的作用和分子机制。研究方法:1.免疫印迹法检测RPB1蛋白分别在AML细胞株、初发原代样本、脐带血、正常人外周血样本中的表达情况;采用共聚焦免疫荧光技术分析RPB1蛋白在AML细胞株、原代样本、脐带血、外周血干细胞中的表达及定位;采用免疫印记法检测磷酸化的RPB1蛋白在AML细胞株、磁珠分选的CD34+的AML细胞、正常人干/祖细胞的表达情况;采用实时荧光定量PCR技术检测POLR2A在AML细胞株、原代样本、正常人外周血样本中的表达。分析TCGA数据库中POLR2A在AML及其他30种肿瘤样本中mRNA表达水平。2.采用相关性分析来探索RPB1的表达与AML原代样本发病时白细胞数和生存时间的相关性,分析POLR2A在不同类型血液肿瘤及造血干细胞样本中的表达情况。3.首先构建诱导性敲除POLR2A的AML细胞株,通过生长曲线、软琼脂克隆形成实验、细胞凋亡、细胞周期变化来探究沉默RPB1对AML细胞增殖、生存、周期的影响。4.构建过表达RPB1的AML细胞株,通过生长曲线、软琼脂克隆形成检测RPB1表达对细胞生长、增殖的影响。5.应用转录组测序技术分析敲除POLR2A后AML细胞基因表达的差异,并对差异基因进行归类分析。6.构建小鼠移植瘤模型,体内实验研究沉默RPB1后小鼠体内成瘤情况及AML细胞对RPB1转录抑制剂雷公藤甲素抗白血病治疗的反应。研究结果:1.相对于正常人外周血细胞,RPB1在AML细胞株及部分原代样本中高表达。并且查询TCGA数据库POLR2A在AML样本中转录水平高于正常人外周血细胞。2.在AML原代样本中,RPB1高表达与AML细胞恶性增殖成正相关,RPB1高表达的AML患者总体生存时间明显低于RPB1低表达的患者,并且POLR2A在不同谱系的白血病样本的表达没有明显差异。3.通过构建可诱导的CRISPR/Cas9敲除系统来诱导性沉默RPB1,加入诱导剂第4天,POLR2A-KO的AML细胞中RPB1蛋白水平降低至6.81%,并且沉默RPB1后细胞的增殖活性下降,细胞出现凋亡,细胞周期阻滞在S期。4.RPB1过表达的AML细胞增殖能力和集落形成能力都增强。5.应用转录组测序技术分析RPB1沉默组和对照组AML细胞的差异基因,以1.5倍差异为界筛选出1836个差异表达基因,其中995个基因表达下调,10%的表达下调基因与癌症有关。6.和体外结果一致,接种可诱导性沉默RPB1表达的AML.细胞的小鼠在诱导性沉默RPB1后第7天,肿瘤信号明显下降,并且诱导性沉默RPB1的表达后小鼠对转录抑制剂雷公藤甲素抗白血病治疗更加敏感。研究结论:1.异常激活的RPB1是驱动急性髓系白血病细胞增殖和阻抑细胞凋亡的一个关键的致癌枢纽基因。2.靶向沉默RPB1可以消退AML小鼠模型的肿瘤细胞,并且增强转录抑制剂雷公藤甲素的抗白血病治疗活性。