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狂犬病是由一种单链RNA病毒引起的致死性脑脊髓炎,所有温血动物和人类普遍对该病毒易感,发病后死亡率几乎100%。接种疫苗是预防狂犬病最主要的手段。目前国内主要的人用和兽用狂犬病疫苗是灭活疫苗,灭活疫苗的安全性好,但存在免疫原性差的缺点。提升灭活疫苗的免疫原性主要有两种渠道:一是选择免疫原性更好的毒株,二是使用活性好的新型佐剂。本研究将一株通过反向遗传系统改造后获得的含有双G基因的重组狂犬病毒r CVS-11-G经细胞适应、培养、灭活后分别与三种多糖(IIP-A-1、IIP-2和PCP-II)复合后制备免疫原,通过实验免疫小鼠和犬评价其免疫原性。1.重组狂犬病毒r CVS-11-G的鉴定、细胞适应与培养。重组病毒r CVS-11-G额外插入的G基因表达稳定,不会因为传代而丢失;r CVS-11-G能够在BSR和Vero细胞上能高效稳定地复制,在BSR细胞上滴度较为稳定,稳定在5×108TCID50/m L-109TCID50/m L之间,在Vero细胞上滴度稳定在108 TCID50/m L左右。大量培养r CVS-11-G重组病毒,为免疫原的制备奠定基础。2.小鼠实验免疫研究。重组狂犬病毒r CVS-11-G经灭活后分别与板蓝根中提取的多糖IIP-A-1、IIP-2和自茯苓中提取的多糖PCP-II复合后制备免疫原,免疫小鼠。免疫后采血,分离血清。通过FAVN方法测定抗狂犬病毒中和抗体效价;分离外周血单核淋巴细胞通过流式细胞术测定外周血中B、T淋巴细胞的活化状态。采集小鼠腹股沟淋巴细胞制备单细胞PBS悬液,通过流式细胞术测定其中B细胞活化状态。采集小鼠脾脏,分离脾细胞通过ELISpot和胞内因子染色测定其脾细胞中分泌IL-4和IFN-γ的细胞数;通过ELISA测定脾细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的数量。最后通过攻毒保护实验以及暴露后免疫实验评价该免疫原是否能够保护小鼠应对狂犬病毒街毒株致死剂量的攻击。实验结果表明,通过与最常用的铝胶佐剂对比,r CVS-11-G复合三种多糖均后能够诱导较高的特异性体液免疫和细胞免疫,效果好于铝胶佐剂,且能保护更多的小鼠免受致死剂量的狂犬病毒街毒株的攻击。3.犬实验免疫研究。选择佐剂活性最好的多糖PCP-II,复合灭活重组狂犬病毒r CVS-11-G制备免疫原后免疫犬,进行加强免疫实验以及梯度免疫实验。同时设立铝胶佐剂对照组以及梅里亚商品化疫苗对照组。实验结果表明,该免疫原相比商品化疫苗和铝胶佐剂组能诱导更强的回忆效应,产生更快更高的中和抗体效价。犬梯度免疫实验结果证明PCP-II与少量灭活r CVS-11-G结合制备免疫原后,即可诱导一个较为理想的中和抗体效价,且抗体效价高于相同免疫剂量的铝胶佐剂组。小结:重组病毒r CVS-11-G额外插入的G基因表达稳定,在BSR和NA细胞上能高效稳定地复制,病毒滴度在108TCID50/m L-109TCID50/m L之间;相比传统的铝胶佐剂,上述三种植物多糖,尤其是PCP-II,结合灭活重组狂犬病毒r CVS-11-G制备免疫原后,免疫小鼠能诱导的更高的中和抗体效价,活化更多淋巴细胞的同时,促进淋巴细胞分泌更多的具有免疫调节作用的细胞因子,且能针对狂犬病毒街毒株提供更好的保护效果;免疫犬后能诱导相比商品化疫苗更高的抗体效价。三种植物多糖,尤其是PCP-II是一种良好的兽用狂犬病疫苗候选佐剂。本研究为一种高效、廉价兽用灭活狂犬疫苗(双G+糖佐剂)的研发奠定了前期基础,同时也为人暴露后免疫用狂犬疫苗佐剂的研发提供了参考数据。