金属钛在骨骼、关节等领域的再生修复中广泛应用,但是钛移植物在机体中的细胞相容性较弱,细胞难以粘附和伸展、不利于细胞增殖。钛表面改性是解决这一问题的重要方法。明胶是胶原蛋白碱性水解或酸性水解的产物,具有利用细胞粘附、伸展和增殖的作用。利用明胶对钛表面改性可以增强钛的细胞相容性,但是明胶溶液在室温下呈凝胶状,需要加热使其溶解,而且明胶在钛表面粘附不牢固,易脱落。为了解决这一问题,我们拟利用3-氨基丙烷-1-磷酸对明胶进行修饰,获得粘附性的磷酸功能化明胶(Phosphonatedgelatin,P‐gelatin),使其更好的固定于钛表面,以提高钛表面的细胞相容性。游离的生长因子在液体的培养环境中易被稀释和代谢,因此使用量大、作用时间短、浓度不易调控。如何更好地发挥其对细胞生长、增殖或分化的调控作用,是组织工程的另一个研究热点。生长因子与粘附性片段相结合,固定于材料表面是解决这一问题的方法。本研究拟利用多巴(DOPA)设计一段粘附性多肽序列,接入到表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)的羧基端,得到多巴功能化表皮生长因子(EGF-DOPA)。以胶原蛋白膜为支架材料,研究EGF-DOPA在胶原蛋白膜上的吸附能力,及其对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的增殖影响。明胶与3-氨基丙烷-1-磷酸进行酰胺化反应得到P-gelatin,核磁共振磷谱检测磷酸基团是否结合到P-gelatin分子中。用圆二色光谱检测P-gelatin的构象变化。通过检测P-gelatin溶液在不同温度下的OD600,分析其凝胶化与温度的关系。将P-gelatin用于钛表面改性,利用飞行时间二次离子质谱分析P-gelatin与钛片的结合情况。用石英晶体微天平检测钛片表面的P-gelatin的表面浓度,用原子力显微镜观察P-gelatin修饰的钛片表面形貌和P-gelatin层的厚度。接触角检测仪检测P-gelatin修饰的钛片表面水和甘油的接触角,研究钛片表面亲水性的变化。圆二色光谱检测结果显示,明胶的二级结构没有因为磷酸功能化而发生显著性变化。凝胶化温度却发生了显著的变化,明胶在磷酸功能化之后,即使浓度为3%的溶液在室温下也不会发生凝胶化。将P-gelatin固定在钛表面后,飞行时间二次离子质谱分析结果表明,P-gelatin与钛存在化学键连接。钛表面P-gelatin的表面浓度随P-gelatin溶液的浓度增大而升高,当溶液浓度大于2%时,表面浓度趋于饱和。原子力显微镜结果显示,P-gelatin在钛片表面形成了厚度约为5nm的粗糙涂层。P-gelatin涂层降低了钛片表面的亲水性,有利于细胞的粘附和伸展。细胞培养实验结果显示,P-gelatin对钛片的修饰显著促进小鼠成骨细胞MC3T3的粘附、伸展及增殖。用固相合成的方法将含有DOPA的粘附性氨基酸序列,连接于EGF的羧基端,得到EGF-DOPA。通过圆二色光谱对比EGF-DOPA和EGF的二级结构。用ECL方法检测EGF-DOPA在胶原蛋白膜表面的固定能力。用CCK-8法分别检测游离的和固定在胶原蛋白膜表面的EGF-DOPA对细胞增殖的影响。圆二色光谱实验结果表明,EGF-DOPA没有明显的构象改变。然而由于多巴结构的强粘附性,EGF-DOPA在胶原蛋白膜表面的粘附量显著高于EGF。游离的EGF-DOPA对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的促进作用与EGF相似。固定在胶原蛋白膜表面后,EGF-DOPA对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的促进作用显著高于EGF。这是由于多巴功能基团的高黏附性,使生长因子更好的发挥促细胞增殖作用。综上所述,本课题成功地制备了P-gelatin和EGF-DOPA。这两种生物活性分子用于生物材料表面改性,可以提高生物材料的细胞相容性。利用这两种功能性蛋白分子对生物材料进行表面修饰,可以作为生物材料表面改性的新方法,为获得表面功能性生物医用材料的提供了新的思路。