家蚕是一种具有很高经济价值的绢丝昆虫,有大量的基础研究积累,已经逐渐发展成鳞翅目的模式生物。然而,家蚕易受到环境中各种病原微生物和寄生虫等威胁,发生疾病。昆虫致病性真菌,如绿僵菌、球孢白僵菌、黄曲霉菌和米曲霉菌,都可能引发高致病性蚕病,严重影响茧丝产量和质量,给整个桑蚕行业造成重大经济损失。昆虫致病性真菌,作为一种新型生物农药,已被广泛应用于农林害虫防治和蚊虫控制。真菌生物农药的使用,不可避免的会与家蚕发生交叉感染,可能导致蚕病爆发。因此,阐明昆虫致病性真菌与家蚕相互作用的分子机制,发现新的抗真菌分子,不仅有利于提高家蚕抗真菌能力,而且对农林害虫防治及人类真菌疾病治疗也具有重要意义。昆虫致病性真菌,通过利用丰富的水解酶来穿透昆虫体壁。这些水解酶包括体壁降解蛋白酶和几丁质酶,它们都是重要的毒力因子。过表达这些毒性蛋白酶,可以显著增强致病性真菌的毒力。虽然真菌穿透昆虫体壁的基本模式已经提出,但昆虫是怎样抵御真菌入侵以及与真菌之间具体的相互作用如何都不甚明了,有待于进一步研究。昆虫体壁和血液中含有丰富的蛋白酶抑制剂,这些抑制剂与抵御病原微生物入侵密切相关。为了阐明昆虫抵御真菌入侵的分子机制以及为提高家蚕抗真菌能力寻找新的分子靶标,我们重点对丝氨酸蛋白酶抑制剂进行深入研究。本研究室利用基因芯片技术对家蚕在微生物诱导下的基因表达变化进行调查,发现了19个家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂在微生物经口感染家蚕后,上调或者下调表达,初步表明这些丝氨酸蛋白酶抑制剂可能参与防御病原微生物入侵的过程。特别是TIL(trypsin inhibitor-like cysteine rich domain)家族的蛋白酶抑制剂在球孢白僵菌感染后明显上调表达。因此,可以从家蚕蛋白酶抑制剂中寻找能够有效对抗致病性真菌入侵的蛋白分子,以提高家蚕抗真菌能力。基于此,本论文对TIL家族的BmSPI38和BmSPI39进行了全长克隆、原核表达和活性测定,并对其抵御真菌入侵的分子机理进行了深入的研究；利用3D结构预测和定点突变技术,对BmSPI38和BmSPI39的抑制活性的关键位点进行了分析；并对BmSPI38和BmSPI39在家蚕中的生理存在形式及BmSPI39在茧丝保护中的功能进行了系统的研究。本论文获得的主要研究结果如下：1.丝氨酸蛋白酶抑制剂的全长克隆、原核表达及活性测定基于BmSPI38和BmSPI39(?)勺EST序列,我们对这两个基因分别设计了4个基因特异引物,用于该基因的5’RACE扩增和3’RACE扩增,获得了这两个基因的全长cDNA序列。BmSPI38和BmSPI39都具有一个含有八个半胱氨酸残基的TIL结构域。多序列比对结果表明,与其它物种的丝氨酸蛋白酶抑制剂相比,BmSPI38和BmSPI39的TIL结构域中有2个Cys发生了替换’(Cys2th和Cys6th),且活性位点也发生了明显变化。基于独特的活性位点和保守的Cys数目,我们认为BmSPI38和BmSPI39是TIL家族丝氨酸蛋白酶抑制剂的新成员。系统发生树分析显示,所有TIL类蛋白酶抑制剂聚为3支,家蚕BmSPI35、 BmSPI36、BmSPI37、BmSPI38、BmSPI39、BmSPI40和BmFPI-F(家蚕真菌蛋白酶抑制剂-F)聚为一支(Group Ⅲ),铃蟾BbBSTI独自聚为一支(Group Ⅱ),其余丝氨酸蛋白酶抑制剂聚为一支(Group Ⅰ)。家蚕BmSPI38、BmSPI39与其它物种的TIL家族的蛋白酶抑制剂进化关系较远,而与BmFPI-F的序列相似性较高,推测它们与BmFPI-F具有相似的功能,参与家蚕的免疫过程。利用原核表达技术,我们获得了具有生物活性的BmSPI38和BmSPI39重组蛋白。通过对不同温度或pH条件下的抑制剂活性进行测定,我们发现BmSPI38和BmSPI39具有很高的热和酸碱稳定性。为了确定BmSPI38和BmSPI39所抑制的蛋白酶的类型,我们选择了几种蛋白酶来进行酶活测定实验,结果表明BmSPI38和BmSPI39能够强烈地抑制微生物蛋白酶,如枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K,但对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶都没有抑制活性。2.BmSPI38和BmSPI393(?)寸真菌体壁降解蛋白酶的抑制及其动力学特征分析为了探讨BmSPI38和BmSPI39是否参与抵御昆虫致病性真菌,我们选取了球孢白僵菌Prl蛋白酶(CDEP-1)来进行酶活抑制和体外结合实验。结果表明,BmSPI38和BmSPI39能够强烈地抑制球孢白僵菌的毒力蛋白酶CDEP-1。RT-PCR分析表明,BmSPI38在头、体壁和脂肪体等免疫相关组织中高量表达,暗示其可能通过抑制真菌分泌的体壁降解蛋白酶,进而阻止真菌穿透表皮侵染家蚕；BmSPI39在家蚕前部和中部丝腺中特异表达,可能参与丝腺相关的某种过程。与绿僵菌的Prl蛋白酶相似,CDEP-1能够诱导家蚕的黑化反应。而BmSPI38和BmSPI39能阻断CDEP-1诱导的黑化反应。这表明,家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39(?)能够抑制CDEP-1蛋白酶诱导的杀虫性黑化,进而保护家蚕。酚氧化酶前体体外激活实验表明,CDEP-1不能直接激活PPO,可能是通过激活PPO上游的某种蛋白因子,间接激活PPO。本研究阐明了家蚕应对真菌伤害的另一种途径,即阻断昆虫致病性真菌分泌的蛋白酶引发的有害黑化。球孢白僵菌感染后108h,家蚕血液发生了一定程度的黑化,且黑化程度与分生孢子浓度在一定程度上具有正相关性,表明酚氧化酶级联的黑化反应,参与对真菌入侵的免疫应答。本研究中使用的枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K和体壁降解蛋白酶CDEP-1都属于Peptidases_S8家族,具有一个Peptidases_S8结构域。序列分析表明,Peptidases_S8家族相似性很高,已报道的体壁降解蛋白酶主要是PCSK9_ProteinaseK_like亚家族与Subtilisin_subset亚家族中成员,是真菌重要的毒力因子。鉴于枯草杆菌蛋白酶类的相似性很高,且BmSPI38和BmSPI39能够强烈地抑制这些微生物蛋白酶活性,我们认为蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39有助于提高家蚕的抗真菌能力。3.蛋白酶抑制剂抑制球孢白僵菌的入侵为了研究BmSPI39等蛋白酶抑制剂是否参与家蚕对真菌的免疫应答,我们利用不同浓度的球孢白僵菌感染家蚕,并对攻毒后不同时间点的体壁中的BmSPI39进行Western blot分析。结果表明,家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI39以四聚体形式在体壁中表达,在球孢白僵菌感染后,先上调表达,后下调表达,参与家蚕对真菌的免疫应答。免疫荧光实验表明,BmSPI39主要定位于内表皮和中表皮中。鉴于该抑制剂能够抑制真菌的体壁降解蛋白酶活性,我们认为体壁中的蛋白酶抑制剂可能是通过抑制真菌的体壁降解蛋白酶活性,来减缓真菌对昆虫体壁的穿透过程。为了进一步研究蛋白酶抑制剂能否增强家蚕的抗真菌能力,我们将蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39重组蛋白作为球孢白僵菌孢子悬液的添加剂,通过体表浸泡法处理家蚕。单独应用球孢白僵菌或与BSA、BmSPI38或BmSPI39等一起处理家蚕。实验结果表明,随着攻毒后时间的增加,家蚕的累积发病率逐渐增加。截止到第5天,单独使用球孢白僵菌攻毒的家蚕累积发病率为64.67%,而使用BSA、BmSPI38或BmSPI39重组蛋白添加剂的的家蚕累积发病率分别为44.44%、18%和8%。我们对攻毒处理第5天的家蚕进行观察,发现单独使用球孢白僵菌和以BSA作为添加剂的处理组,多数家蚕表现为：体壁出现黑色破损病斑,体色加深无光泽,体表脱水下陷,活动性差,触摸感觉迟钝等现象。而蛋白酶抑制剂BmSPI38或BmSPI39的重组蛋白的处理组中,多数家蚕没有明显的发病征兆。家蚕体壁出现黑色斑点,说明家蚕体壁中存在酚氧化酶级联系统,当球孢白僵菌感染家蚕时,会激活家蚕的黑化反应,从而参与抵御真菌的免疫应答。意外的是,蚕蛹节间膜没有发现明显的黑色斑点,这可能是由于节间膜处缺乏酚氧化酶级联系统,不能有效激活黑化反应。通过对五个不同处理组的生存率进行统计分析,发现BmSPI38和BmSPI39都能够显著提高家蚕的生存率,表明蛋白酶抑制剂能够增强家蚕的抗真菌能力,可以作为提高家蚕抗性的靶标基因。4.蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39的抑制特异性关键位点分析家蚕蛋白酶抑制剂与其它物种的TIL类蛋白酶抑制剂的多序列比对结果表明,BmSPI38和BmSPI39的氨基酸序列中有两个半胱氨酸发生了替换,因此,我们推测这两个位置的氨基酸残基是决定其抑制活性的关键位点。利用定点突变技术将这两个位置的Asp和Leu分别突变为Cys。我们对BmSPI39突变前后的三维结构进行了建模预测。结果表明,BmSPI39中只含有2个反平行的β折叠片和一个小α螺旋,其余区域都是柔性的loop区域。整个结构中含有四对二硫键(Cys29-Cys62、 Cys40-Cys5、Cys44-Cys92和Cys64-Cys76),它们维持了蛋白刚性结构的稳定,使大片的柔性loop区域形成一个相对紧凑而又具有一定柔性的稳定结构。将BmSPI39与突变后的BmSPI39Mu的三维结构进行叠合比较发现,新突变的两个Cys分别位于相邻的两个loop区域,它们会形成一个分子内二硫键,并将相邻的两个loop区域拉近,同时,Thr36m-O和Thr61m-N形成一对氢键以稳定该结构的变化。新生成的二硫键(Cys38m-Cys58m)与相邻的二硫键(Cys40m-Cys54m)一起形成一个稳定的刚性区域,P1残基Ala56m正好处于这个刚性区域中间。将BmSPI38和BmSPI39中的两个氨基酸定点突变为半胱氨酸,突变后的BmSPI38Mu和BmSPI39Mu对枯草杆菌蛋白酶类的抑制活性大大降低,表明这两个位置的半胱氨酸替换是BmSPI38和BmSPI39获得抑制微生物蛋白酶能力的一个重要原因。然而,BmSPI38Mu和BmSPI39Mu没有获得对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶等的抑制能力,推测P1残基在决定其抑制特异性中起重要作用。通过对TIL家族蛋白酶抑制剂活性位点及半胱氨酸数目进行分析,蛋白酶抑制剂的抑制特异性与TIL结构域中的半胱氨酸数目和P1残基性质及大小存在很大的关联。本研究表明,在进化过程中,家蚕TIL家族蛋白酶抑制剂中P1残基替换为小分子的中性氨基酸,使其获得了一定程度的抑制微生物蛋白酶活性的能力,半胱氨酸的替换增强了其抑制的活性和特异性。5.BmSPI38和BmSPI39体内存在形式的分析及在茧壳保护中的功能研究利用还原与非还原SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF MS和胶内活性染色技术,我们对BmSPI38和BmSPI39重组蛋白的存在形式进行了分析。结果发现,BmSPI38和BmSPI39重组蛋白主要以多聚体形式存在。Western blot结果表明,BmSPI38和BmSPI39主要以四聚体形式分布于各组织器官中,可能以多聚体形式在家蚕中执行功能。RT-PCR及Western blot结果表明,BmSPI39在5龄第5天家蚕的前部和中部丝腺特异表达,推测BmSPI39可能参与丝腺相关的某种过程。BmSPI39在上蔟前的丝腺中高量表达,并随着泌丝过程进入茧壳中。我们的研究表明,蛋白酶抑制剂BmSPI39能够通过抑制微生物蛋白酶对茧壳蛋白的水解过程,从而为预蛹和蛹提供长效有力的保护。