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基因治疗是指将遗传物质导入患者体内,使患者获得有益治疗的一种新型治疗方式,它是根治遗传性疾病的最直接和有效的方法.造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)因具有自我更新和多谱系分化的能力成为基因治疗的最理想的靶细胞.基因治疗的基本目标是外源基因整合于HSC的染色体.由于该打靶载体是种一质粒载体,基因转移效率会直接影响以后的基因治疗效果.为了更方便、直观地观察并检测对人红白血病细胞的基因转染条件,同时便于富集靶细胞,我们将标记基因-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因克隆到打靶臂之外tk基因下游的BamHI位点.经过同源重组以后,EGFP基因被整合掉,不会影响γ-基因的表达.我们将质粒AV53HS432中的4.7kbHS432与质粒pHS40γ中的γ-珠蛋白基因共同克隆到打靶载体的打靶臂之间获得大小为22.8kb的EHγ重组体.我们用RNase保护实验(RNase protection assay,RPA)检测γ-珠蛋白基因在K562细胞中的表达.用Hemin诱导各单克隆细胞分化,4天后,提取细胞总RNA,进行RPA检测.其中15个未经Hemin诱导的克隆的RPA实验结果显示:γ-珠蛋白基因在稳定整合克隆中的表达量较对照细胞明显为高,其中11个克隆的表达量是对照的1.14-2.9倍,其余四个克隆与对照相比无明显变化,平均表达水平为对照的1.86倍.对经Hemin诱导的7个克隆进行RPA实验的结果表明6个克隆的表达量是对照的1.1-3.29倍,1个克隆的表达无法分析,平均表达水平为对照的1.675倍;并且随着γ-珠蛋白基因的整合及表达增加,α-和ξ-珠蛋白的表达也呈上升趋势,其具体机制有待进一步研究.综合上述结果表明:(1)在DNA水平上,外源γ-珠蛋白基因及其调控序列能够稳定存在于人源打靶载体中;(2)外源基因能完整整合于细胞染色体上不发生缺失、重排;(3)打靶载体的打靶臂能指导外源基因经同源重组后整合于细胞染色体上;(4)完整整合克隆能高效表达γ-珠蛋白基因.在15个未经Hemin诱导的克隆中,有11个克隆的表达量是对照的1.14-2.9倍,另外四个克隆与对照无明显变化,其平均表达水平为对照的1.86倍;经Hemin诱导的7个克隆中的6个克隆的γ-珠蛋白基因表达量是对照的1.1-3.29倍,平均为1.675倍;(5)随着γ-珠蛋白基因表达量的增加,α-和ξ-珠蛋白的表达也呈上升趋势.