枯草芽孢杆菌XZ18-3的鉴定及其抗菌机制和菌剂制备研究

来源 :河南工业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:lst39889667
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禾谷丝核菌侵染引起的纹枯病对小麦危害最严重的真菌病害之一,近年来对小麦真菌性土传病害的防治多采用的是化学方法,利用各种化学杀菌剂杀死或者抑制小麦纹枯病病原菌,但是化学防治容易造成耐药性,不利于对小麦纹枯病的防治,还会加重环境污染,对人畜健康带来威胁。采用生物农药来防治小麦纹枯病是比较理想的选择。(1)禾谷丝核菌拮抗细菌的筛选及鉴定。本研究从西藏自治区阿里地区普兰县普兰镇荒漠草原采集的黑钙土,采用梯度稀释法从中分离得到119株形态差异的菌株。以禾谷丝核菌为病原指示菌利用平板对峙法和牛津杯法进行抑菌实验,复筛出6株对禾谷丝核菌有拮抗作用的细菌,其中菌株XZ18-3的抑菌效果最明显,对禾谷丝核菌的抑菌率为36.57%;抗菌谱广,对禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、假禾谷镰刀菌、离蠕孢菌等多种病原菌均具有较强的抑菌效果,通过对菌株XZ18-3进行形态学观察、生理生化特征分析以及分子生物学研究将其鉴定为枯草芽孢杆菌,并命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XZ18-3)。(2)枯草芽孢杆菌XZ18-3的发酵条件优化。通过单因素试验,得到菌株最适发酵碳源、氮源、无机盐、接菌量、pH值、发酵时间和转速分别为:葡萄糖2.0%、蛋白胨2.0%、MgSO40.5%、接菌量1.0%、pH7.0、发酵时间60 h、转速100 r/min。为了确定其可靠性,在单因素的基础上,对枯草芽孢杆菌XZ18-3进行发酵培养条件优化,以抑菌率(Y)为响应值,通过Plackett-Burman试验设计筛选出主要因素分别为无机盐、发酵时间和转速。在Plackett-Burman试验设计基础上利用Box-Behnten试验设计进行3因素3水平的响应面试验,以抑菌率(Y)为响应值,运用Design-Expert 8.0.6软件对响应值进行回归方程分析,得到枯草芽孢杆菌的最佳发酵培养条件为:葡萄糖2.00%、蛋白胨2.00%、MgSO4 1.25%、接菌量1.00%、温度37℃、pH6.97、转速180 r/min、发酵时间48 h,在此条件下抑菌率达到57.25%,与之前(36.57%)相比提高了56.55%,对其进行发酵验证结果是可靠的。(3)菌株XZ18-3发酵液的理化性质研究。通过对XZ18-3菌株发酵液进行理化性质检测试验,结果表明,菌株发酵液长时间在紫外和光照条件下比较稳定,蛋白酶对其进行处理也能保持较高稳定性,其热稳定性和酸碱稳定性对菌株发酵液的影响较小。结果表明XZ18-3菌株发酵液具有较好的理化性质,在相对极端环境条件下性质稳定、抑菌率可以维持在一个稳定的水平,具有一定的耐受力。(4)拮抗菌XZ18-3发酵液对禾谷丝核菌的抗菌机制。通过光学显微镜和透射电子显微镜观察显示,经过发酵液处理后的菌丝体数量较多,菌丝体颜色较深,且不规则呈网状交叉,菌丝细胞膜出现凸起、凹陷、破裂,细胞内有的细胞器解体,形成了大量的空白区域。XZ18-3菌株发酵产生的代谢物能够抑制菌丝的生长,在生物量的测定中对照组与实验组相比菌丝湿重和干重分别减少了53.08%、30.00%。结果表明,XZ18-3菌株发酵液破坏了禾谷丝核菌的细胞膜,致使细胞内的可溶性糖、可溶性蛋白以及核酸等大分子的泄漏,导致菌体死亡。对XZ18-3菌株发酵代谢物中的酶进行检测显示,该菌株产蛋白酶、葡聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶,其中蛋白酶和葡聚糖酶的含量最高。(5)枯草芽孢杆菌菌株XZ18-3水剂和可湿性粉剂的研制。以抑菌活性为指标,对表面活性剂、紫外保护剂、稳定剂、防腐剂等进行筛选,确定了Bacillus subtilis菌株XZ18-3水剂的最佳配方为:0.10 mg/mLSDS、0.02 mg/mL蔗糖、0.02 mg/mL羧甲基纤维素钠、0.14 mg/mL柠檬酸钠。以润湿时间、悬浮率、含水率、菌株活性等为指标,对载体、分散剂、润湿剂、稳定剂、紫外保护剂等进行筛选,确定了Bacillus subtilis XZ18-3可湿性粉剂的最佳配方为:高岭土30.0%、聚乙烯醇4.0%、吐温-80 8.0%、山梨醇2.0%、聚乙二醇2.0%,枯草芽孢杆菌发酵液补足100%。对该制剂进行各项指标检测,均达到标准。盆栽防效实验表明:该可湿性粉剂对小麦纹枯病有较好的防治效果,将其稀释100倍后防治效果也能达到60.29%,并且该菌属于枯草芽孢杆菌,是一种无致病性的安全微生物,可以作为一种绿色环保的生防菌剂应用于小麦纹枯病的防治。
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