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研究目的:
近年来恶性淋巴瘤发病率和死亡率逐年上升,结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型(extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type, ENKTL)作为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)的一种特殊类型,在亚洲发病率较欧美高。其侵袭性高,预后极差,易耐药、复发,目前尚无标准治疗及有效预后评估指标,据此,对其发病机制的研究,探讨新方案和预后指标就显得尤为重要。
研究发现,miR-30b、CCL22、Wnt/β-catenin通路蛋白在B细胞淋巴瘤的发生、发展及治疗中发挥作用,提示可能与肿瘤耐药有关,而这些分子在ENKTL中的作用尚不清楚;顺铂是临床用于治疗ENKTL患者常用的二线化疗药物,对于复发、难治的ENKTL治疗非常重要;目前ENKTL体外细胞研究常采用SNK-6和YTS细胞株。
本文拟探讨miR-30b对ENKTLSNK-6和YTS细胞株顺铂耐受的调控及其作用机制。
研究方法:
①培养正常NK细胞和ENKTL细胞株SNK-6和YTS细胞
②Real-timePCR法检测SNK-6和YTS细胞miR-30b和CCL22mRAN表达
③Westernblot法检测正常NK细胞、SNK-6和YTS细胞中CCL22和Wnt/β-catenin通路蛋白表达
④细胞转染:SNK-6和YTS细胞中分别转染miR-30bmimics和miR-30binhibitor
⑤MTT法检测顺铂对miR-30bmimics和miR-30binhibitor转染SNK-6和YTS细胞株生存的影响
⑥caspase-3试剂盒检测miR-30bmimics和miR-30binhibitor转染SNK-6和YTS细胞株caspase-3活性
⑦流式细胞术检测检测miR-30bmimics和miR-30binhibitor转染SNK-6和YTS细胞株凋亡水平
⑧TargetscanHuman7.0软件预测CCL22可能为miR-30b的靶基因
⑨双荧光素酶实验检测miR-30b与CCL22的靶向关系
研究结果:
①与正常NK细胞相比,SNK-6和YTS细胞中miR-30b表达均显著降低,CCL22mRAN与蛋白表达水平均显著升高。
②miR-30b过表达可降低SNK-6和YTS细胞活性,顺铂耐受性显著降低,细胞凋亡比例显著增多,Caspase-3活性增加。miR-30b抑制剂作用与miR-30b过表达作用相反。
③TargetscanHuman7.0软件预测CCL22为miR-30b的靶基因。
④荧光素酶活性分析显示MiR-30b过表达显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度,而结合位点突变后荧光素酶活性不变,表明CCL22是miR-30b的靶分子。
⑤miR-30b过表达显著降低SNK-6细胞CCL22表达,并抑制Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、c-myc、CyclinD1的表达。
⑥CCL22过表达可激活SNK-6Wnt/β-catenin通路并增加细胞活性,降低Caspase-3活性,逆转miR-30b的作用,增加顺铂耐受性。
研究结论:
miR-30b可通过靶向CCL22降低SNK-6和YTS细胞的顺铂耐受性,且此作用可能与抑制Wnt/β-catenin通路活化有关。本研究拓宽了对ENKTL的发病机制的认识,为探索新的分子特异性的临床预后评估体系及新的治疗策略提供理论依据。
近年来恶性淋巴瘤发病率和死亡率逐年上升,结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型(extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type, ENKTL)作为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)的一种特殊类型,在亚洲发病率较欧美高。其侵袭性高,预后极差,易耐药、复发,目前尚无标准治疗及有效预后评估指标,据此,对其发病机制的研究,探讨新方案和预后指标就显得尤为重要。
研究发现,miR-30b、CCL22、Wnt/β-catenin通路蛋白在B细胞淋巴瘤的发生、发展及治疗中发挥作用,提示可能与肿瘤耐药有关,而这些分子在ENKTL中的作用尚不清楚;顺铂是临床用于治疗ENKTL患者常用的二线化疗药物,对于复发、难治的ENKTL治疗非常重要;目前ENKTL体外细胞研究常采用SNK-6和YTS细胞株。
本文拟探讨miR-30b对ENKTLSNK-6和YTS细胞株顺铂耐受的调控及其作用机制。
研究方法:
①培养正常NK细胞和ENKTL细胞株SNK-6和YTS细胞
②Real-timePCR法检测SNK-6和YTS细胞miR-30b和CCL22mRAN表达
③Westernblot法检测正常NK细胞、SNK-6和YTS细胞中CCL22和Wnt/β-catenin通路蛋白表达
④细胞转染:SNK-6和YTS细胞中分别转染miR-30bmimics和miR-30binhibitor
⑤MTT法检测顺铂对miR-30bmimics和miR-30binhibitor转染SNK-6和YTS细胞株生存的影响
⑥caspase-3试剂盒检测miR-30bmimics和miR-30binhibitor转染SNK-6和YTS细胞株caspase-3活性
⑦流式细胞术检测检测miR-30bmimics和miR-30binhibitor转染SNK-6和YTS细胞株凋亡水平
⑧TargetscanHuman7.0软件预测CCL22可能为miR-30b的靶基因
⑨双荧光素酶实验检测miR-30b与CCL22的靶向关系
研究结果:
①与正常NK细胞相比,SNK-6和YTS细胞中miR-30b表达均显著降低,CCL22mRAN与蛋白表达水平均显著升高。
②miR-30b过表达可降低SNK-6和YTS细胞活性,顺铂耐受性显著降低,细胞凋亡比例显著增多,Caspase-3活性增加。miR-30b抑制剂作用与miR-30b过表达作用相反。
③TargetscanHuman7.0软件预测CCL22为miR-30b的靶基因。
④荧光素酶活性分析显示MiR-30b过表达显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度,而结合位点突变后荧光素酶活性不变,表明CCL22是miR-30b的靶分子。
⑤miR-30b过表达显著降低SNK-6细胞CCL22表达,并抑制Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、c-myc、CyclinD1的表达。
⑥CCL22过表达可激活SNK-6Wnt/β-catenin通路并增加细胞活性,降低Caspase-3活性,逆转miR-30b的作用,增加顺铂耐受性。
研究结论:
miR-30b可通过靶向CCL22降低SNK-6和YTS细胞的顺铂耐受性,且此作用可能与抑制Wnt/β-catenin通路活化有关。本研究拓宽了对ENKTL的发病机制的认识,为探索新的分子特异性的临床预后评估体系及新的治疗策略提供理论依据。