论文部分内容阅读
花生是世界第四大油料种子作物,在全世界范围内的热带和亚热带地区种植。中国是世界上生产花生最多的国家之一。决定食用植物油品质的一个主要因素是脂肪酸的构成。花生油主要含有油酸和亚油酸,油酸能降低人体内低密度脂蛋白胆固醇(LDL)含量,同时并不会降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL);而含亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸高的植物油会同时降低LDL、HDL。现有的品种中油酸与亚油酸的比值偏低,因此提高花生油中油酸的含量已成为世界花生品质改良的主要方向。为了改良花生的油酸组成,本研究采用了分子生物学、生物信息学技术和基因工程手段研究了花生的油酸改良。通过同源克隆途径分别克隆了油酸脱氢酶基因的编码区及片段,同时克隆了胚特异表达启动子,通过酶切和连接构建了胚特异表达FAD2的反义RNA植物表达载体和RNAi的中间表达载体;并通过冻融法将植物表达载体转化农杆菌,并用于遗传转化研究。其主要结果如下: 1.为了使目的基因在花生胚中特异表达,根据网上已发表的序列信息合成引物,分别利用PCR技术从大豆中分离得到油体蛋白基因oleosin的启动子和β-伴球蛋白α‘亚基的启动子(7S),;从油菜中分离得到油菜1.7S napin种子贮藏蛋白(napA)基因的启动子(2S);从胡萝卜中分离得到胡萝卜Lea族基因Dc3的启动子(Dc3)。将7S、2S和Dc3启动子构建到克隆载体pGM-T中,并进行测序,oleosin启动子构建到中间表达载体pSPROK中,并进行了测序鉴定。测定结果表明:7S启动子的长度为878bp,与GenBank上引用的序列的同源性为99.8%;2S启动子的长度为1145bp,与GenBank上引用的序列的同源性为100%;Dc3启动子的长度为153bp,与GenBank上引用的序列的长度为100%;启动子oleosin-a与oleosin-b的长度分别为595bp和319bp,与GenBank上引用的序列的同源性为分别为97%和96%。 2.从花生中提取基因组DNA,根据GenBank上发表的△12脂肪酸脱氢酶基因的序列来设计引物,利用PCR技术从花生叶片中分离得到了两个不同长度的目的片段:FAD2-1和FAD2-2,然后与大豆油体蛋白基因oleosin的启动子相连,先构建在pSPROK中间表达载体上,进而构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,已得到三个反义RNA表达载体,分别命名为pCAMBIA1300-2a、pCAMBIA1300-2b和pCAMBIA1300-1a。测序表明,FAD2-2已经插入到植物表达载体pCAMBIA1300中,该片段长度为593bp,含有一个558bp的编码区,编码186个氨基酸,与已报道的序列具有97%的同源性;FAD2-1已经插入到植物表达载体pCAMBIA1300中,该片段长度为1175bp,含有一个1140bp的编码区,编码380个氨基酸,与已报道的序列具有99%的同源性;目前这三个表达载体已转化农杆菌LBA4404,并对花生进行了遗传转化研究。 3.分别从花生叶片中分离得到了△12脂肪酸脱氢酶基因的四个目的片段,长度为200bp和400bp。构建到中间表达载体pKANNIBAL中,获得了两个ihpRNA中间表达载体。编号分别为pKANNIBAL-Ⅰ+Ⅱ和pKANNIBAL-Ⅲ+Ⅳ。这两个中间表达载体已在网上登录,登录号为DQ462470和DQ462471。 总之,通过本研究我们共构建了3个FAD2的反义RNA植物表达载体,2个ihpRNA的中间表达载体,这为之后通过遗传转化,改良花生的脂肪酸组成奠定了前期工作基础。