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急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)为临床常见的危重症,主要表现为急性呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿。ALI/ARDS可发生于任何年龄段的患者,通常由严重感染、创伤、休克等因素诱发。但迄今为止其发病机制尚未完全阐明。近年来,病理研究结果显示,ALI/ARDS发生时受损伤最明显的结构是肺泡上皮,尤其是肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT-1)对损伤更敏感,而且这种损伤常常发生在ALI/ARDS的早期阶段。小窝蛋白(Caveolin, Cln)是一个相对分子质量为21-24kD的膜蛋白,高度富集于蛋白小窝膜(Caveolea, Cle),是Cle的标志性蛋白,具有多种潜在功能,在维持Cle形态、结构、功能中起重要作用。目前发现,哺乳动物中至少存在3种Cln基因家族产物,即Cln-1,Cln-2及Cln-3。其中Cln-1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜,并有证据表明Cln-1/Cle在肺泡上皮屏障功能变化中扮演重要角色。本研究应用pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒载体转染原代培养肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT-1)和c57BL6小鼠,并观察Caveolin-1基因对LPS致炎AT-1细胞和小鼠的影响及作用机制,为临床防治ALI/ARDS提供新的思路。研究内容和方法:1.小鼠Cln-1基因的克隆及载体构建:PCR法扩增Cln-1 cDNA全长基因序列,将其克隆至慢病毒表达载体pRNAi-u2.6上并进行慢病毒包装。2.肺泡Ⅰ型上皮细胞分离、培养:PE标记的AT-1细胞特异性抗体RTI40标记细胞,采用抗PE的免疫磁珠阳性筛选AT-1细胞,流式细胞仪测定纯度。3.慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1转染AT-1及鉴定:慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1病毒上清转染AT-1细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,流式细胞仪测定转染效率,用Western-blotting法鉴定转染AT-1细胞中目的蛋白表达情况。4. Cln-1基因对LPS致炎AT-1细胞的影响及作用机制:(1) LPS致炎AT-1细胞模型:AT-1细胞分为转染目的基因的实验组及转染空载体的对照组,均给予LPS刺激,浓度10μg/ml,分2hr和4hr两个时相点。(2) ELISA法测定LPS致炎细胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表达水平。(3)荧光定量PCR法检测LPS致炎AT-1细胞cPLA2和p38 MAPK mRNA表达变化。(4) Western blotting法检测LPS致炎AT-1细胞cPLA2、p38 MAPK蛋白表达变化。(5) EMSA法检测LPS致炎AT-1细胞核蛋白NF-κB表达变化。(6)特异性阻断cPLA2、p38 MAPK、NF-κB后,细胞上清液TNF-α、IL-6表达水平变化及相互作用。5.观察Cln-1基因对LPS致炎小鼠的影响及作用机制:(1)慢病毒载体pRNAi-u2.6-Cln-1转染c57BL6小鼠及LPS致炎小鼠模型:c57BL6小鼠分为转染目的基因的实验组及转染空载体的对照组,经尾静脉注入caveolin-1慢病毒载体,1月后给予腹腔注射LPS,2mg/kg,分2hr和4hr两个时相点。(2) ELISA法测定LPS致炎小鼠血清的TNF-α、IL-6表达水平。(3) Western blotting法检测LPS致炎小鼠肺组织cPLA2、p38 MAPK蛋白表达变化。(4)病理形态学观察LPS致炎小鼠肺组织HE染色切片。结果:1. PCR法成功扩增出Cln-1 cDNA全长序列,并将其克隆至慢病毒表达载体pRNAi-u2.6,病毒包装后得pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒。2.获得原代培养的肺泡Ⅰ型上皮细胞,纯度可达85%~98%,细胞总量为3-5×10~6。3.慢病毒载体转染肺泡Ⅰ型上皮细胞后,在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光,细胞转染效率>95%。Western blotting法可检测到相应目的蛋白的表达,24hr后Cln-1表达开始升高,36hr的表达量比转染前表达量显著升高,72hr达到峰值。4. LPS干预AT-1细胞后,在2hr及4hr时相点,高表达Cln-1实验组细胞上清液TNF-α、IL-6的表达水平均显著高于对照组,P<0.05。实验组AT-1细胞cPLA2和p38 MAPK mRNA的表达均显著高于对照组,P<0.05;Western blotting结果显示,cPLA2和p38 MAPK总蛋白及磷酸化蛋白水平也同步升高,P<0.05。EMSA法测定核蛋白的表达结果显示:实验组NF-κB的表达均显著高于对照组,P<0.05。阻断cPLA2/p38 MAPK及下游转录因子NF-κB均可引起炎症因子(TNF-α、IL-6)显著下降,p<0.05。cPLA2抑制剂可以下调磷酸化的p38 MAPK及NF-κB的表达,p<0.05;p38 MAPK抑制剂能够降低磷酸化的cPLA2及NF-κB的表达,p<0.05,而NF-κB的抑制剂对磷酸化的cPLA2和p38 MAPK表达无明显影响,p>0.05。5. LPS干预c57BL6小鼠后,在2hr及4hr时相点,高表达Cln- 1实验组小鼠血清TNF-α、IL-6的表达均显著高于对照组,P<0.05。实验组小鼠肺组织cPLA2和p38 MAPK蛋白表达水平均显著高于对照组,P<0.05。小鼠肺组织病理切片显示实验组小鼠肺部渗出、水肿更明显,损伤更严重。结论:1.成功构建Cln-1基因高表达的肺泡Ⅰ型上皮细胞模型。2. Caveolin-1加重LPS引起的肺泡I型上皮细胞和小鼠肺部损伤。3. Caveolin-1上调cPLA2及其信号通路下游分子p38 MAPK、NF-κB,是LPS引起的肺泡I型上皮细胞和小鼠肺部损伤的可能机制。4.特异性阻断cPLA2、p38 MAPK及NF-κB可以减轻LPS引起的细胞炎性反应。