论文部分内容阅读
2型糖尿病（Type2diabetesmellitus,T2DM）是一种以慢性高血糖为特征的严重代谢性疾病,占糖尿病患者90%以上。我国是世界上T2DM发病率最高的国家之一,T2DM患者人数居全球首位,其高发病率以及严重的并发症已成为我国公共卫生事业的巨大威胁。中医将糖尿病列为消瘅、消渴之列,在两千多年的实践中积累了众多治疗糖尿病的宝贵经验。甘草是我国应用最广泛的大宗药材之一,素有“国老”的美誉。异甘草素（Isoliquiritigenin,ISL）是甘草中分离得到的查尔酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理活性。课题组前期对近15年甘草活性成分抗糖尿病的SCI论文进行了综述,发现ISL治疗T2DM的研究主要集中于糖尿病并发症,且多从炎症和氧化应激角度入手,对ISL降血糖的效果及改善T2DM的分子机制缺乏系统研究。因此,本课题拟探索ISL治疗T2DM的潜力及可行性,阐明其分子机制,为开发新型抗T2DM临床药品奠定基础。本论文在对 T2DM 患者 GEO（Gene Expression Omnibus datasets）数据进行生物信息学分析的基础上,通过高脂高糖饮食喂养加腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）构建T2DM小鼠模型,采用腹腔注射ISL治疗,检测给药前后空腹血糖水平,结合口服糖耐量测试分析ISL降血糖的效果。在体内水平上,开展了组织病理学分析、血液生化参数检测、肝脏糖原合成与糖异生相关酶活性测定、肝脏脂肪生成与转运相关基因转录水平测定和线粒体功能测定,从而分析ISL降血糖的效果和对糖、脂代谢以及线粒体功能的调控。在体外水平上,利用HepG2和INS-1细胞系,结合Western blot、RT-qPCR、ELISA等实验方法,对体内实验的结果进行验证,并解析ISL发挥治疗T2DM作用的分子机制。本论文取得如下结果:（1）T2DM患者肝脏组织GEO芯片数据生物信息学分析:本课题组筛选了 T2DM患者组和正常组肝脏组织样本,分析差异表达基因,并进行GO（Gene ontology）和 KEGG（Kyoto encyclopediaof genes and genomes）富集分析,发现:T2DM的发生发展与肝脏线粒体结构和功能、多种代谢途径、氧化应激相关过程等密切相关,涉及的最主要通路为PI3K/AKT（Phosphoinositide 3-kinase/Protein kinase B）信号通路。（2）异甘草素治疗T2DM体内药效学研究:本论文成功构建了高糖高脂饮食诱导的T2DM小鼠模型,腹腔注射给药后检测发现ISL能稳定发挥降血糖功效,显著降低T2DM小鼠糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin,GH）和糖化血清蛋白（Glycosylated serum protein,GSP）的水平,且无明显副作用。糖代谢相关研究表明ISL可增加T2DM小鼠肝糖原积累,提高肝脏葡萄糖激酶（Glucokinase,GCK）和糖原合酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）的活性水平,进而调节T2DM小鼠糖代谢紊乱。脂代谢相关研究表明ISL可降低T2DM小鼠血清游离脂肪酸（Free fatty acids,FFA）、总胆固醇（Total cholesterol,T-CHO）和总甘油三酯（Totaltriglycerides,T-TG）的水平,降低其肝脏乙酰辅酶A羧化酶 1（Acetyl CoA carboxylase 1,ACC1）、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1）和甾醇调节元件结合蛋白 1c（Sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1c）的转录水平,改善肝脏脂肪的合成和转运,从而调节T2DM小鼠脂代谢紊乱。线粒体功能相关研究表明ISL可显著降低T2DM小鼠肝脏ATP及线粒体活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平,但不影响线粒体蛋白量和线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）水平,从而调节 T2DM 小鼠能量代谢失衡。（3）异甘草素治疗T2DM体外分子机制解析:本论文采用胰岛素敏感的HepG2 和 INS-1 细胞系,结合 Western blot、RT-qPCR、ELISA 等方法对 ISL 抗T2DM的分子机制进行解析,发现:首先,ISL可在短时间内（5min）快速强烈激活一磷酸腺苷激活蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）,提高其蛋白磷酸化水平,推测ISL可直接作用于AMPK的催化亚基,且分子对接结果也证实了 ISL可与AMPKα亚基稳定结合。其次,ISL可调控PI3K/AKT信号通路,提高AKT蛋白磷酸化水平,上调葡萄糖转运体4（Glucose transporter4,GLUT4）的转录水平,从而提高细胞对胰岛素信号的敏感性,并增加细胞糖摄取能力。我们同时观察到ISL可下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）转录水平并抑制其复合体 1（Mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）的活性。由于 mTORC1 对胰岛素信号通路PI3K/AKT具有负反馈调节作用,因此mTORC1的抑制与上述AKT的激活结果相吻合。再次,ISL可调控线粒体功能,降低细胞ATP水平和ROS水平,上调细胞MMP,上调线粒体基因组水平,上调线粒体生物发生相关基因,包括:增殖体激活受体共激活体 1 α（Proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 α,PGC-1α）和线粒体转录因子（Mitochondrial transcription factor A,TFAM）的 mRNA表达水平,下调线粒体裂变相关基因,包括:线粒体动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1,Drp1）和线粒体分裂蛋白 1（Mitochondrial fission protein 1,Fis1）的mRNA水平;上调线粒体融合相关基因,包括:PTEN诱导激酶1（Phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1,PINK1）、线粒体融合蛋白 1（Mitofusin 1,MFN1）和MFN2的mRNA表达水平。综合以上实验结果,本论文得出以下结论:ISL具有良好的降低T2DM小鼠血糖的功效,同时可缓解T2DM小鼠糖代谢、脂代谢紊乱,调节T2DM小鼠线粒体功能,且效果优于阳性药二甲双胍（Metformin,MET）。其分子机制为:ISL对于能量代谢中心蛋白AMPK具有快速而强烈的激活作用,从而影响其下游各代谢通路;ISL可激活AKT,抑制mTORC1,从而提高胰岛素信号通路PI3K/AKT的敏感性,提高细胞糖摄取能力,缓解胰岛素抵抗;ISL可提高GCK和GSK-3β酶活性促进肝糖原合成,改善肝脏糖代谢水平;ISL可降低ACC1、FAS、SCD1和SREBP1c的转录水平,改善肝脏脂肪的合成和转运;ISL可调控线粒体功能,抑制ATP水平和ROS水平,促进线粒体生物发生,促进线粒体融合,并抑制线粒体裂变,进而调控细胞能量代谢。