糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的发病率与日俱增,而其伴随的并发症对健康也产生了巨大威胁,例如骨质疏松、周围神经病变、糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)等,据统计全球大概有20%-40%的I型或II型糖尿病病人会发展成为DN。DN是慢性肾病死亡的首要原因,它大概占到全世界终末期肾病的50%。DN的典型特征是肾小球对蛋白质的通透性增加以及肾小球系膜细胞(Glomerular Mesangial Cell,GMC)的胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)沉积,上述病理改变最终造成肾小球硬化症以及严重的肾脏损伤。由于肾脏移植手术的高额费用,因而全世界与日俱增的DN发病率是一个非常敏感的普遍问题。高血糖及糖代谢紊乱在DN发生发展中起重要作用,如果导致肾损伤程度达到终末期,其可选择的治疗方法非常有限。目前在临床上,治疗DN主要是通过药物来控制血糖浓度,以及应用保护肾脏的药物,来达到联合治疗的目的。但是,上述药物对于部分DN患者往往副作用较大、耐药性差。因而,探求一种既安全又有效的非药物治疗DN的方法配合保护肾脏的药物来联合治疗DN显得非常必要。低强度电磁场(Low-intensity Electromagnetic Fields,LEMFs)作为一种非侵入式治疗手段,有促进术后创伤愈合、减轻组织水肿、消炎止痛等效果。糖尿病本身是一种慢性炎症的病变,能引起系膜区ECM中间产物的增加并减缓其降解速度,从而形成ECM沉积进而发展成为肾小球硬化症。Norton在1988年就已经发现LEMFs有助于降解体外培养的软骨细胞和皮肤纤维细胞ECM成份。因此,如果LEMFs的干预能有效减少系膜细胞的ECM合成并提高其降解,将有助于对DN患者肾脏的保护。有相关研究报道了波长为670 nm的低强度的光照(一种极高频的电磁波)可改善链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠的肾脏功能以及抗氧化的能力。俄罗斯学者曾采用低强度特高频(300-3000MHz)治疗设备,用于治疗小儿血糖代谢紊乱引起的肾损伤,并发现能缓解损伤程度以及阻止新的类脂聚积引起的渐进性坏死的发生。这些研究虽然能反映出电磁场对糖尿病肾病模型动物和患者都有一些积极的作用,但是缺乏系统的实验探讨其可能的机理,而且这两个的实验均采用高频电磁场,其产生的热效应也是不可忽视的。除此之外,近几十年内很少有相关实验研究能引起国内外学者的广泛关注。因此,本课题旨在研究LEMFs对于大鼠糖尿病肾病的影响,为防治糖尿病肾病提供新的思路和实验依据。全文主要探讨了以下三个问题:(1)LEMFs的干预能否影响大鼠DN模型细胞ECM代谢;(2)三种不同波形LEMFs中哪种波形对ECM合成降解及相关信号通路影响最大;(3)LEMFs的干预能否对DN模型大鼠的肾脏起一定保护作用。第一部分研制一种能输出任意波形的电磁发生平台目的:电磁生物效应研究中,最主要的环节就是搭建电磁发生平台。在长期的研究中,我们基本采用模拟电路搭建平台,如果需要改变电磁参数,就需要另外设计电磁发生装置,使研究周期大大加长,而且本研究中也涉及多种波形参数。因此,需要研制一款可以输出任意波形的低强度电磁发生平台。方法:采用虚拟仪器技术、模块化设计、可编程思路编写数字信号发生软件,实现了数字信号输出,通过D/A采集卡转换成模拟信号,再进行功率放大,最后线圈负载输出。结果:该平台只需要重新编写软件的“波形模块”部分,就能得到需要的参数,理论上能够输出任意波形的LEMFs。结论:该平台可方便输出不同波形并确保其一致性,使实验设计更加科学,有利于优化电磁参数。ECM代谢的影响第二部分研究不同波形LEMFs对高糖培养的肾小球系膜细胞株(HBZY-1)目的:LEMFs参数多样,无法一一进行研究,在初步的细胞实验中,我们选择三种在电磁非热生物效应研究中较为常用的波形参数。如何解决ECM异常堆积,是目前研究和治疗肾小球硬化症的主要方向,本部分就是研究LEMFs对DN模型细胞ECM代谢产物的表达以及参与调节ECM的主要信号通路是否有积极的影响,并找到三种波形中的最优参数。方法:实验采用1.6m T、15Hz的正弦、方波、脉冲群分别对高糖培养的HBZY-1细胞株进行干预(8 h/d),连续3d。完成后采用MTT法检测细胞活性,ELISA法检测上清液中TGFβ1、FN、MMP-2蛋白含量,荧光定量PCR检测TGFβ1、FN、MMP-2 m RNA含量,Western blot法检测p38MAPK、ERK、Smad3总蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果:1、所有高糖组在1d后都表现出较强的细胞活性,与正常组比较具有显著差异;与高糖对照组进行比较,方波和脉冲群组在干预2d时开始抑制HBZY-1细胞株的增殖,正弦组始终没有显著差异;脉冲群组细胞活性显著低于方波组。2、所有高糖组的TGFβ1、FN蛋白表达显著高于正常组,MMP-2则相反;方波和脉冲群组TGFβ1、FN蛋白表达显著低于高糖对照组,而在MMP-2蛋白的表达上显著高于高糖对照组,正弦组在这些蛋白表达上与高糖对照组无显著差异;脉冲群组在TGFβ1蛋白表达上显著低于方波组,而在MMP-2蛋白表达上则相反,在FN蛋白表达上则无显著差异。3、所有高糖组的TGFβ1、FN m RNA表达显著高于正常组,MMP-2则相反;方波和脉冲群组TGFβ1、FN m RNA表达显著低于高糖对照组,而在MMP-2 m RNA的表达上显著高于高糖对照组,正弦组在这些m RNA表达上与高糖对照组无显著差异;脉冲群组在TGFβ1、FN m RNA表达上显著低于方波组,在MMP-2 m RNA表达上则相反。4、所有高糖组的磷酸化Smad3蛋白相对表达量显著高于正常组;脉冲群组磷酸化Smad3蛋白相对表达量显著低于高糖对照组,而方波和正弦组无显著差异。5、所有高糖组的磷酸化p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相对表达量显著高于正常组;方波和脉冲群组磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量显著低于高糖对照组,而正弦组无显著差异;与方波组相比,脉冲群组磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量显著低于方波组;脉冲群组磷酸化ERK蛋白相对表达量显著低于高糖对照组,而方波和正弦组无显著差异。结论:方波和脉冲群能有效地抑制高糖诱导的HBZY-1细胞的增殖,一方面通过抑制系膜细胞TGFβ1、FN的合成减少ECM的沉积,另一方面通过促进MMP-2的合成加速ECM降解。此外,方波和脉冲群还通过抑制TGFβ1/Smad3、MAPK信号通路减少系膜细胞的损伤。脉冲群对系膜细胞的作用效果显著好于方波。第三部分研究PEMFs对STZ诱导的糖尿病大鼠DN的影响。目的:用体外研究得到的最优参数(PEMFs)对I型糖尿病大鼠进行干预,研究在体环境下PEMFs对DN大鼠肾脏的保护效果,并验证其对ECM代谢产物以及参与调节ECM的通路的影响能否跟体外实验结果相印证。方法:将成年SD雄鼠随机按体重的匹配分为3组:正常组(非糖尿病大鼠)、模型组(糖尿病模型大鼠)以及脉冲群组(糖尿病模型+PEMFs照射,8 h/d)。干预6 wks后处死取样,通过光镜和电镜来检测肾脏的形态学结构,q RT-PCR检测肾皮质TGFβ1、FN、MMP-2 m RNA表达,Western blot法测肾皮质TGFβ1、FN、MMP-2、Smad3、p38MAPK、ERK、p-Smad3及p-MAPK蛋白表达。结果:1、经过6 wks的PEMFs照射,注射STZ患有DN大鼠的低体重和高血糖症状并无缓解。2、PEMFs对于糖尿病大鼠DN病程的发展,能够缓解模型大鼠肾脏结构的病理改变,其表现为与模型组相比光镜下较轻的肾小球、肾小管--间质损伤,以及电镜下较轻的肾小球基底膜与足细胞损伤。3、与对照组比较,模型组和脉冲群组肾皮质TGFβ1、FN m RNA的表达显著高于对照组,而MMP-2 m RNA的表达则相反;与模型组比较,脉冲群组能显著抑制肾皮质TGFβ1、FN m RNA的表达,但是显著促进MMP-2 m RNA表达。4、与对照组比较,模型组和脉冲群组肾皮质TGFβ1、FN蛋白的表达高于对照组,而MMP-2蛋白表达则相反;与模型组比较,脉冲群组能显著抑制肾皮质TGFβ1、FN蛋白的表达,但是显著促进MMP-2蛋白表达。5、模型组和脉冲群组的磷酸化Smad3、p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相对表达量显著高于对照组;脉冲群组磷酸化Smad3、p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相对表达量显著低于模型组。结论:通过体内实验研究,组织病理学结果证明PEMFs的干预能缓解DN大鼠肾损伤的病理改变过程,其分子机制可能是通过抑制TGFβ1/Smad3、MAPK信号通路的作用,从而影响相关蛋白(TGFβ1、FN、MMP-2)的表达,进而起到缓解DN肾损伤的病理改变的作用,与体外实验的结果一致,这也证明了TGFβ1/Smad3、MAPK信号通路是参与DN发生发展各种途径中的重要通路。总结通过对电磁场非热生物效应的研究积累,我们创新性地提出LEMFs可能通过调节ECM代谢缓解DN病程的理论,也是首次系统地通过体内外实验研究了LEMFs对大鼠DN的影响,初步证明了LEMFs中的方波和脉冲群能够缓解高糖诱导的HBZY-1细胞ECM代谢紊乱,抑制TGFβ1介导的Smad3、MAPK信号通路减轻系膜细胞损伤,再通过体内实验进一步验证了脉冲群通过调解ECM代谢并且抑制TGFβ1介导的Smad3、MAPK信号通路缓解DN肾损伤程度。我们的实验研究将LEMFs的修复损伤、消炎消肿的功效与糖尿病引起的肾损伤结合,发现了LEMFs能够缓解DN肾损伤程度,并在微观和宏观的层面共同揭示了其可能的分子机制,为防治糖尿病肾病提供新的思路和实验依据。