背景：肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是以肺动脉压力进行性升高，继而引起右心室肥大、右心功能衰竭，并最终导致患者死亡的一大类疾病。其肺血管的基本病理变化，早期以肺动脉痉挛收缩为主，后期出现以肺动脉内膜、中膜（平滑肌层）和外膜增厚为主要表现的血管重塑。近年来的研究表明，肺动脉平滑肌细胞(pulmonary areterial smooth muscle cells，PASMCs)内钙离子浓度（[Ca2+]i）、钾离子浓度（[K+]i）升高（包括其各自通道的变化）在肺动脉平滑肌（pulmonary arterial smooth muscle，PASM）收缩和重塑过程中，起了至关重要的作用。升高的[Ca2+]i可与钙调蛋白（calcium modulin，CaM）结合，形成 Ca2+-CaM复合物，该复合物进一步结合并激活胞质内的肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK），活化的MLCK使粗肌丝原肌球蛋白横桥的肌球蛋白轻链（myosinlight chain，MLC）磷酸化（P-MLC），P-MLC进而激活横桥 ATP酶，分解 ATP提供能量引发肌丝滑动，平滑肌收缩。细胞质或细胞核中升高的[Ca2+]i还可激活一些钙依赖激酶（如钙调蛋白激酶，CaMK）及其他转录因子[如c-Fos，激活的T细胞的核因子(nuclear factor of activated T-cells, NFAT), cAMP反应元件结合蛋白(response element binding protein, CREB)]等，促使休眠细胞进入增殖周期，促进PASMCs增殖。细胞内细胞器（如肌质网）释放钙和细胞外液钙通过细胞膜上的各种钙通道进入细胞，是细胞内[Ca2+]i增高的两个途径，其中后者起主要作用。细胞膜上的钙通道主要有电压依赖性钙通道（voltage dependent calcium channels， VDCCs）、受体操纵性钙通道（receptoroperatedcalcium channels，ROCCs）、钙池操纵性钙通道（store operatedcalcium channels，SOCCs）和钠钙交换体（Na+/Ca2+exchangers，NCX）等。目前对ROCCs结构与功能的研究尚不充分， NCX功能改变常继发于VDCCs和SOCCs的变化（具体见本文最后讨论）。目前研究较为一致的观点是，在肺动脉高压过程中，VDCCs及 SOCCs活性和/或数量增加，导致细胞外钙离子进入细胞内增多，胞内[Ca2+]i增加，诱发远端肺动脉平滑肌细胞持续收缩和增殖，是促进肺动脉高压发生的重要机制之一。细胞膜电压依赖性 K+通道（Kv）功能降低或表达减少，在促进肺动脉收缩和增殖方面也发挥着重要作用。钾通道功能降低或表达减少一方面可使细胞静息膜电位（Em）上升，激活VDCCs，促进细胞外钙离子内流，升高[Ca2+]i，引起PASM收缩和增殖；另一方面，钾外流减少可使动脉平滑肌[K+]i增高，高[K+]i抑制细胞内半胱氨酸天门冬氨酸氨基转移酶活性，后者促凋亡作用降低，增殖/凋亡平衡被打破，也促进肺动脉重塑和肺动脉高压进展。因此，从理论上推测，细胞膜上的钙通道和钾通道，都可能成为肺动脉高压治疗药物的作用靶点。只要能够抑制细胞膜上的钙离子通道数量表达（或活性）和/或提高钾离子通道数量（或功能），即可降低细胞内钙离子浓度，延缓甚至逆转肺动脉高压进展。目前治疗PH的靶向药物仅有4类，但专利产权全部掌握在发达国家几个为数不多制药企业，药品价格极为昂贵，因此寻找和开发我国具有自主知识产权、适合我国患者消费能力的PH治疗药物非常必要。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），又名川芎嗪（ligustrazine），是从我国传统中药川芎(ligusticum chuanxiong)中提取的活性成分之一，上世纪80年代曾被证明具有一定的钙离子拮抗作用，近年被用来治疗肺源性心脏病，取得了令人满意的效果，但其具体作用机制尚不清楚。本文拟就 TMP治疗肺动脉高压的具体作用及机制展开研究。　　目的：探索TMP治疗低氧及野百合碱诱导肺动脉高压大鼠模型的有效剂量和安全性；体内及体外环境下，分别探讨其对PASMCs[Ca2+]i和经典瞬时受体电位蛋白（canonicaltransient receptor potential protein，TRPC）、Kv的影响；体外环境下，TMP对PASMCs增殖、迁移和毒性作用，揭示TMP治疗PH的分子机制，为将来肺动脉高压药物的开发提供参考。　　方法：⑴SPF级雄性 SD大鼠，体重（235-271）g(不同批次)，随机分为常氧（normoxia，N）、N+TMP100mg/kg?d、缺氧(hypoxia，H)、H+TMP50mg/kg?d、H+TMP100mg/kg?d、H+TMP200mg/kg?d，每组5只，组间体重无差异。N组常氧（21％O2）、H组低氧（11±0.5%O2）干预21天后，分别测量各组大鼠右心室压力（RVP）、右心室肥厚指数[RV/(LV+S)]、肺、肝、肾组织HE染色、血液学检查肝功能、肾功能，确定 TMP体内有效安全剂量，此后不同批次大鼠模型均按此有效、安全剂量给药。⑵显微分离N、N+TMP、H和H+TMP组d-PAs，其中部分血管平滑肌经胶原酶法消化、离心分离得到PASMCs，三气培养箱培养24-48h，细胞贴壁后， InCyte细胞内钙浓度检测系统测细胞内基础钙浓度及锰淬灭。后者可间接评价钙池操纵性钙内流(store operated calcium entry，SOCE）大小。另一部分d-PA提取RNA或蛋白后通过荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测经典瞬时受体电位通道蛋白（canonicaltransient receptor potentialprotein，TRPC）1和TRPC6 mRNA及蛋白表达变化；荧光定量PCR法检测Kv1.5和Kv2.1mRNA表达变化。⑶显微分离正常大鼠d-PAs，胶原酶消化分离血管平滑肌，培养PASMCs，通过MTT法确定不同浓度TMP对PASMCs增殖影响，联合测定培养基乳酸脱氢酶（LDH）确定体外 TMP的安全有效用药浓度；Transwell法测定 TMP对PASMCs迁移的影响。⑷显微分离正常大鼠远端肺动脉（distal pulmonary arteries，d-PAs）平滑肌，胶原酶消化分离血管平滑肌，常氧及缺氧条件下培养PASMCs，TMP暴露或不暴露60h后，InCyte细胞内钙浓度检测系统测细胞内基础钙浓度及锰淬灭。提取细胞 RNA或蛋白后通过荧光定量 PCR和免疫印迹法分别检测 TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表达变化；荧光定量PCR法检测Kv1.5和Kv2.1mRNA表达变化。⑸野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导大鼠 PH模型，予 TMP治疗，通过右心室压力、右心肥厚指数、肺部病理等评价其疗效；提取肺动脉平滑肌RNA或蛋白后通过荧光定量 PCR和免疫印迹法分别检测 TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表达变化；荧光定量PCR法检测Kv1.5和Kv2.1mRNA表达变化。　　结果：①成功建立慢性低氧性肺动脉高压（chronic hypoxic pulmonaryhyperten-sion, CHPH）大鼠模型。低氧21天后，大鼠mRVP升高、d-PAs壁明显增厚、RV/(LV+S)增大、心肌细胞肥大。②TMP对CHPH大鼠模型有治疗作用；低于200mg/kg?d的剂量对常氧和低氧大鼠是安全的；100mg/kg?d和200mg/kg?d对低氧性肺动脉高压大鼠的治疗效果相同。③成功体外培养原代PASMCs，细胞具有典型肺动脉平滑肌形态结构和功能，完全满足后续实验需要。④CHPH大鼠模型PASMCs[Ca2+]i和SOCE增加，而TMP可显著抑制这种变化。与此一致的是，CHPH大鼠模型d-PAs的Kv1.5、Kv2.1表达明显降低， TRPC1、TRPC6表达升高，而TMP可显著逆转这种变化。⑤低氧培养的PASMCs增殖、迁移增加，TMP干预后，其增殖率、迁移率降低；干预浓度下，未检测到TMP的细胞毒性。⑥低氧培养正常大鼠PASMCs可使[Ca2+]i和SOCE增加，TMP可抑制二者的增加。低氧培养的PASMCs Kv1.5、Kv2.1表达降低，TRPC1、TRPC6表达增高，TMP可升高Kv、降低TRPC的表达。⑦TMP对MCT诱导的PH大鼠模型同样具有治疗作用，对Kv1.5、Kv2.1和TRPC1、TRPC6的影响同低氧模型。　　结论：⑴TMP可安全、有效改善CHPH大鼠模型d-PAs重塑，降低右心室压，降低右心室肥厚指数。⑵治疗浓度TMP对PASMCs产生明显抑制增殖和迁移的作用，且这种作用不依赖与其毒性作用。⑶体内外实验均证实低氧可使大鼠PASMCs基础[Ca2+]i和SOCE增加，Kv1.5和Kv2.1表达降低，TRPC1和TRPC6表达增加，而TMP可有效降低基础钙浓度、SOCE、TRPC1、TRPC6，提高Kv1.5和Kv2.1表达。⑷TMP对MCT诱导的大鼠PH模型干预效果同低氧模型。