叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官,叶片的发育主要包括叶原基的起始,叶片极性的建立以及分化发育三个步骤。探明叶片的发育机制,不仅可以使我们更深入地了解植物叶的发育机理,还可以帮助我们通过转基因等生物手段对叶型和株型进行改良。蒺藜苜蓿是豆科模式植物,具有最简单的复叶发育模式,这为我们研究复叶发育提供了有利条件。本论文包括两部分,分别对JAGGED基因和ARP/KNOXI调控模块在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能开展了研究工作。第一部分:JAGGED(JAG)是叶发育的关键基因,在蒺藜苜蓿中有两个同源基因MtJAG1和MtJAG2。我们利用反向遗传学手段在蒺藜苜蓿Tnt1逆转录转座子插入突变体库中筛选到了这两个基因的突变体。MtJAG1和MtJAG2的单突变体都没有明显表型,同时二者在染色体上位置相邻,很难通过有性杂交获得双突变体,因此我们利用CRISPR/cas9基因编辑技术,在mtjag1(-/-)突变体背景下对MtJAG2进行敲除。mtjag1(-/-)mtjag2(+/-)T0代转基因植株在发育后期大部分叶片呈现不同程度的叶裂加深以及一个侧叶缺失或退化的表型,表明MtJAG存在剂量效应。T1代分离出的mtjag1 mtjag2双突变体具有严重的发育缺陷,表现为植株矮小,叶片随着发育进程叶裂加深并逐渐简化为针形叶甚至失去叶柄。对其生殖期叶原基进行扫描电镜观察结果表明其侧叶原基未正常起始而导致复叶变为单叶。进一步分析表明,mtjag1 mtjag2植株叶片的近远轴极性建成紊乱,其针形叶片的表皮细胞发生显著改变,类似于野生型叶脉细胞。另外,mtjag1 mtjag2侧叶向内聚拢,无法进行正常叶片运动,这暗示着控制叶片运动的叶枕发育异常。野生型叶枕是一个被远轴化的器官,但是在双突变体中远轴面表皮细胞伸长,维管束近轴面韧皮部缺失,推测其远轴化趋势减弱。除此之外,与拟南芥的jagged突变体一样,mtjag1和mtjag2具有狭窄的花器官,而且mtjag1 mtjag2花瓣之间的融合程度削弱,雄性和雌性器官均发育异常无法结实。叶片和花器官的发育异常暗示JAG在植物侧向器官发育中的功能非常保守,而且MtJAG在近远轴极性建成中具有非常重要的作用,其分子机制仍有待我们后续深入的探索。第二部分:我们之前的研究结果表明,mtphan突变体在营养生长期叶柄长度与野生型相比基本没有变化,但在生殖生长期叶柄长度明显变短,因此我们提出假设,这一现象可能与MtKNOXI基因家族在叶柄处异位表达相关,同时这一表达模式受到年龄途径相关基因的调控。我们在mtphan叶柄和小叶柄处检测到MtKNOXI的表达量随时间上调。另外,对在野生型和mtphan背景下的proMtKNOXI:GUS转基因植株叶片分别进行GUS染色,结果表明MtKNOXI在mtphan的叶片尤其是叶柄中有异位表达。mtphan mtknox7和mtphan mtknox1 mtknox2 mtknox6 mtknox7的生殖期叶柄长度相较于mtphan和mtphan mtknox1 mtknox2 mtknox6有明显恢复。这一遗传学证据表明在MtKNOXI中,MtKNOX7对mtphan的叶柄缩短起主要作用。miR156是目前已知的唯一一个年龄分子标记,其表达量随植株生长递减,而其靶基因SPLs的表达量逐渐增加。与野生型相比,35S:MtMIR156转基因植株生殖期的叶柄长度无明显差异,且MtKNOX和MtPHAN的表达水平也没有明显变化。但是在野生型植株中敲除miR156,导致MtSPL3表达水平显著升高,同时叶柄长度变短。这一结果表明,随着年龄增加,MtSPL表达水平增高可能导致了叶柄缩短的表型。具有相同表型的突变体往往暗示相同的调控通路,sgl1和fcl1叶柄发育异常,但是分析结果显示,SGL1和FLC1与MtPHAN对叶柄发育的调节属于不同调控通路。未来我们会继续探索蒺藜苜蓿中调控叶柄发育的分子机理。