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背景与目的肠道的黏膜屏障是机体维持肠道菌群平衡、抵御外界病原侵袭的重要屏障结构,主要包括机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障。临床上常因肠系膜血栓、小肠移植、烧伤、创伤、休克和重大手术应激导致肠道的缺血,进而引起肠道局部黏膜缺血缺氧,破坏肠道的黏膜屏障。当肠道恢复血供时会出现再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤,导致肠道通透性增加,进而引起大量炎症因子、内毒素和肠道菌群入血,继发性的引起全身多脏器损伤,如心、肝、肺、肾等,引起全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),并最终诱发多器官功能衰竭(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),甚至导致死亡。机械屏障是肠黏膜屏障中最基础的屏障。一旦机械屏障被破坏,肠道的通透性便会明显增大,水和电解质会从机体中进入肠道,造成体液丢失,加重休克。与此同时,肠道内的细菌会大量进入机体,造成菌群易位,诱发全身炎症反应。紧密连接蛋白claudin家族是普遍认为构成机械屏障的最重要的蛋白,主要维持细胞之间的栅栏功能和屏障功能,在空回肠中主要以claudin-4为主。在众多肠道疾病中,病情的严重程度往往和claudin蛋白的表达密切相关。在肠道缺血的情况下,claudin蛋白的表达会急剧的下降,造成肠道屏障功能的缺失,进而导致炎症因子、内毒素、细菌等进入机体,诱发全身炎症反应。因此,在肠I/R的早期对claudin蛋白的调控对减轻肠屏障损伤的具有重要意义。沉默信息调节因子2(Silent information regulator 2,Sir2)是在研究酵母菌转录沉默时发现的一个广泛存在于各种物种的基因,在DNA损伤的修复、交配型基因的沉默、染色质稳定、以及延长寿命中起重要作用。我们早期研究发现,小肠的SIRT1表达在大鼠小肠I/R后降低。所以SIRT-1可能为调控小肠I/R病理生理过程的重要分子。研究发现,在糖尿病引起的高蛋白尿疾病中,肾小球基底膜上的足突细胞之间的紧密连接蛋白claudin-1明显升高,SIRT-1的表达明显降低。下调SIRT-1或者上调claudin-1蛋白的表达会加重蛋白尿的症状。这意味着SIRT-1在调节细胞之间屏障功能方面起着非常重要的作用。对于SIRT-1在急、慢性病理条件中如何调控紧密连接蛋白claudin-4,特别是在肠I/R后二者之间的关系以及如何保护黏膜屏障功能的机制,目前仍不明确。因此,我们提出科学假说,SIRT-1在急性肠I/R后可以调控紧密连接蛋白claudin-4表达,进而保护因肠I/R后引起的黏膜屏障功能损伤。据此,本研究拟建立体内及体外模型,应用蛋白印迹、免疫荧光、跨上皮电阻测量等技术,探讨缺氧复氧后SIRT-1对claudin-4表达的影响。并通过跨上皮电阻技术测定上皮屏障电阻(Trans-epithelial resistance,TER),明确I/R后激活/抑制SIRT-1的表达对肠上皮屏障的调控,为肠黏膜屏障的损伤及保护研究提供新的思路,为小肠I/R后损伤的治疗提供新的方向。方法1.人体缺血小肠及小鼠肠I/R后小肠claudin-4的变化:收集临床肠系膜血栓的患者5例,切取手术切除之坏死肠段及端侧部分正常肠管,应用蛋白印迹检测肠黏膜正常部分和坏死部分的claudin-4蛋白表达情况。2.SIRT-1调控claudin-4对肠屏障的影响:体内建立肠I/R模型,使用SIRT-1的激活剂白藜芦醇Resveratrol预处理,应用蛋白印迹、免疫荧光检测干预SIRT-1的情况下claudin-4的表达情况。体外利用Caco-2细胞系建立肠上皮缺氧复氧模型,并且使用SIRT-1的激活剂白藜芦醇和抑制剂EX-527进行预处理,检测SIRT-1的表达情况和跨上皮电阻TER的变化情况,应用蛋白印迹、免疫荧光等方法检测干预SIRT-1的情况下claudin-4的表达情况。3.体外利用Caco-2细胞系建立肠上皮缺氧复氧模型,并且使用si-RNA对SIRT-1的表达进行干扰,检测跨上皮电阻TER的变化情况,应用蛋白印迹、免疫荧光、qPCR等方法检测干扰SIRT-1的情况下claudin-4的表达情况。主要结果1.在肠系膜血栓患者切除的肠组织中,坏死部分的肠黏膜claudin-4的表达量明显较正常组织的减少;在小鼠肠I/R模型中,模型组的肠黏膜的claudin-4表达量较对照组的明显减少。2.使用白藜芦醇激活SIRT-1的表达后,可以看到SIRT-1表达明显升高,模型组claudin-4的表达较对照组增多,HE染色可见组织破坏明显减少,免疫荧光可见肠黏膜中claudin-4表达增多。3.在体外实验中,使用白藜芦醇激活SIRT-1的表达后,模型组claudin-4的表达较对照组增多,免疫荧光可见claudin-4表达增多,检测跨上皮电阻TER明显升高;使用EX-527抑制SIRT-1的表达后,模型组claudin-4的表达较对照组明显减少,免疫荧光可见claudin-4表达减少,检测跨上皮电阻TER明显降低。4.在体外实验中,使用si-RNA干扰SIRT-1的表达后,模型组claudin-4的表达较对照组减少,RNA水平表达减少,检测跨上皮电阻TER明显降低。结论1.黏膜屏障的功能会随着claudin-4的表达量减少而降低。通过对claudin-4的调控可以明显缓解肠I/R后黏膜结构破坏。2.上调SIRT-1的表达可以增加紧密连接蛋白claudin-4的表达,进而改善肠屏障功能;下调SIRT-1的表达会减少紧密连接蛋白claudin-4的表达,使得肠上皮细胞跨上皮电阻值降低,加重肠上皮屏障的损伤。