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背景: 先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HSCR)是一种严重且常见的小儿先天性畸形,虽然手术可以挽救生命,但许多患儿仍然合并长期慢性并发症,严重影响患儿生活质量。而解决和缓解患儿肠动力障碍是保守治疗的关键。HSCR临床与动物模型的病理标本研究均表明HSCR患儿严重的肠动力障碍与Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的分布、数量及功能异常密切相关。近年来,T型钙离子通道α1H(Cav3.2)亚型已被证实在 ICC起搏电位的产生与传播中发挥着举足轻重的作用,然而关于Cav3.2在HSCR肠动力障碍发生机制中的角色尚不清楚。在本研究中,我们首先通过免疫组织化学,qRT-PCR,Western blot的方法来证实正常结肠中T型钙离子通道亚型的分布以α1H(Cav3.2)亚型为主。其次,通过建立HSCR动物模型,检测HSCR病变肠段中Cav3.2的表达变化,明确Cav3.2与HSCR之间的相关关系。最后,利用Cav3.2的特异性拮抗剂和激动药物在肌条电生理实验中对HSCR病变肠段及正常对照肠段肌条进行干预,分析Cav3.2对肌条收缩的影响及它们之间可能存在的相互作用机制,从而对Cav3.2在HSCR肠动力障碍发生发展中的作用及其机制进行初步探讨。 目的: 1.通过免疫组织化学,qRT-PCR和蛋白免疫印迹的方法检测正常结肠中T型钙离子通道亚型(Cav3.1, Cav3.2, Cav3.2)的分布情况。 2.通过免疫组织化学,蛋白免疫印迹和免疫荧光双标技术明确Cav3.2及ICC特异性标记物c-kit在HSCR中各自及共同阳性区域表达变化。 3.利用Cav3.2的特异性拮抗剂和激动药物在肌条电生理实验中对HSCR病变肠段及正常对照肠段肌条进行干预,分析Cav3.2对肌条收缩的影响从而初步阐明Cav3.2在HSCR肠动力障碍发生中的作用。 方法: 1.取自5只SD大鼠的结肠,以其大脑组织中的神经元作为阳性对照,利用免疫组织化学、qRT-PCR、Western blot的方法对结肠中T型钙通道亚型的分布进行检测。 2.将80只6-8日龄SD乳鼠随机分为两组,每组40只。干预组经肛门灌注0.2%苯扎氯铵建立HSCR模型,对照组用生理盐水代替苯扎氯铵进行干预。分别在第4、6、8周每组随机抽取10只动物处死,通过大体形态学观察、组织病理学观察、免疫荧光的方法来鉴定HSCR模型是否建立成功。同时通过免疫组化、蛋白免疫印迹和免疫荧光双标技术检测模型大鼠病变肠段中 Cav3.2的分布变化及其与ICC特异性标记物c-kit共变情况。 3.选取建模8周的HSCR大鼠和正常对照大鼠的结肠,利用离体肌条电生理学方法对HSCR病变肠段和正常结肠中的Cav3.2的功能变化进行研究。同时利用Cav3.2的特异性拮抗剂ZnCl2和激动药物Na2S对Cav3.2在肠动力中的调节作用进行研究。 结果: 1.免疫组织化学检测正常结肠组织中T型钙离子通道亚型分布的结果显示:少量的Cav3.1分布于正常结肠组织的粘膜层及粘膜下层;Cav3.3几乎没有表达;而Cav3.2是正常结肠组织中主要表达的T型钙离子通道亚型,其主要分布于环行肌与纵行肌之间,多呈连续分布。qRT-PCR、Western blot结果与免疫组织化学检测结果基本一致,即正常结肠中主要表达的T型钙离子通道亚型是Cav3.2,Cav3.1和Cav3.3几乎没有表达。 2.经肛门灌注0.2%苯扎氯铵处理后8周通过大体形态学观察,组织病理学观察,免疫荧光方法鉴定HSCR模型建立成功,即处理肠段肌间神经节细胞的减少甚至缺如。免疫组织化学方法检测结果显示:在正常结肠组织中,Cav3.2主要分布于环行肌与纵行肌之间,多呈连续分布;而在HSCR模型动物病变肠段,随着处理时间的延长,Cav3.2的分布逐渐减少,连续性遭到破坏。蛋白免疫印迹检测的HSCR病变肠段Cav3.2蛋白表达的变化,结果与免疫组织化学检测一致,随着处理时间的延长,Cav3.2的表达逐渐减少,8周时减少最明显(t=8.626, P<0.001)。免疫荧光双标检测Cav3.2和ICC特异性标记物c-kit共变情况显示:与正常结肠组织中的分布情况相比,HSCR病变肠段组织c-kit和Cav3.2的共同阳性区域明显减少甚至消失。 3.离体肌条组织电生理结果发现:①与对照组正常结肠肌条相比,HSCR病变肠段组织的自发性节律性收缩波基本消失;②在正常结肠肌条产生自发性节律性收缩的前提下,加入Cav3.2的特异性阻滞剂ZnCl2后,肌条的节律性收缩基本消失,与 HSCR病变肠段表现类似;而在 HSCR病变肠段肌条的灌流槽中加入 Cav3.2的特异性阻滞剂ZnCl2后,肌条的收缩活动未出现明显变化;③在正常结肠肌条产生自发性节律性收缩的前提下,向灌流槽中加入Cav3.2的激动药物Na2S后,肌条收缩张力显著增加(t=125.726, P<0.001);而在HSCR病变肠段肌条的灌流槽中加入 Cav3.2的激动药物 Na2S后,肌条的收缩曲线变化不明显(t=1.293, P=0.237);④在正常结肠肌条用 ZnCl2特异性阻滞 Cav3.2后,加入上调 Cav3.2的Na2S,肌条收缩张力明显增加(t=32.294, P<0.001);而在HSCR病变肠段肌条用ZnCl2特异性阻滞Cav3.2后,加入上调Cav3.2的Na2S,肌条收缩活动均无明显变化。 结论: HSCR病变肠段组织T型钙离子通道α1H(Cav3.2)亚型的表达及其与特异性标记ICC的c-kit的共同阳性区域与正常结肠中的表达相比,均明显减少。HSCR病变肠段组织的自发性节律性收缩波基本消失;对照组加入Cav3.2的特异性阻滞剂ZnCl2后,正常结肠肌条的自发性节律性收缩消失,与HSCR病变肠段组织表现类似。以上结果提示Cav3.2的异常很可能介导了HSCR肠段中ICC功能的改变,并最终导致HSCR肠动力障碍的出现,从而为我们进一步探讨 HSCR的发病机理奠定了理论基础。