沙门菌(Salmonella)是一种革兰阴性、兼性厌氧的胞内病原菌,可感染人和多种动物,不仅能引起畜禽的发病和死亡造成严重的经济损失,并可通过被污染的畜禽制品引发人食源性疾病严重危害公共卫生安全。肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis,Salmonella Enteritidis)属于广宿主谱的沙门菌血清型,在过去20年中尽管采取了一系列的防控措施,该菌已逐渐成为导致人沙门菌病的主要血清型之一。沙门菌通过III型分泌系统(TypeⅢ secretionsystem,T3SS)产生一系列的效应蛋白。这些效应蛋白具有多种生物学活性,影响宿主细胞的功能,以利于其感染宿主细胞和在胞内的存活复制,其中包括对肠上皮细胞的紧密连接(Tight junctions,TJs)蛋白及其上游信号分子的调控。人类因食用被沙门菌污染的畜禽制品而感染沙门菌,在条件较差地区也可能因粪便污染而感染。沙门菌引起的人沙门菌病主要症状包括腹痛、痉挛、腹泻、恶心、呕吐、发烧和头痛等。近年来相关报道显示,肠炎沙门菌也与肠道外的感染病例相关,如败血症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、感染性心内膜炎、尿路感染等。沙门菌感染宿主后,炎性反应的发生依赖于多种效应蛋白分子的参与,且不同的效应分子表现出促炎效应或抑炎效应的特征。因此,开展对肠炎沙门菌炎性相关效应蛋白的研究以揭示该菌在感染宿主过程中的炎性反应规律显得尤为重要。AvrA在鼠伤寒沙门菌中为致病岛I(Salmonella pathogenicity island 1,SPI-1)T3SS效应蛋白之一,具有乙酰基转移酶活性,可抑制JNK/AP-1和NF-κB信号通路,AvrA还具有去泛素化酶活性可抑制β-catenin和IκBα的降解,从而抑制NF-κB信号通路和活化β-catenin通路。前期对AvrA效应蛋白功能的研究主要以鼠伤寒沙门菌为对象,而关于肠炎沙门菌的研究涉及很少,效应蛋白AvrA在肠炎沙门菌感染过程中发挥的具体作用也未见报道。本研究首先构建了肠炎沙门菌C50336效应蛋白AvrA的基因缺失株与质粒回复株,其后在体内外感染模型中对肠炎沙门菌C50336野生株及C50336△avrA缺失株对宿主细胞基本炎性反应规律的影响进行了研究,并进一步揭示了该菌中效应蛋白AvrA参与宿主炎性反应的机制。1.肠炎沙门菌C50336△avrA缺失株的构建及其生物学特性利用λ-Red同源重组技术构建了肠炎沙门菌C50336株的avrA基因缺失株,并以pBR322-avrA质粒介导的回补法构建了相应的回复株。开展了对缺失株生物学特性的研究,包括测定缺失株及回复株的生长、生化特性及其对小鼠的致病能力和体外对肠上皮细胞的黏附侵袭及胞内增殖能力。结果显示,肠炎沙门菌avrA基因缺失后:(1)在LB中的生长速度、生理生化特性与野生株、回复株相同;(2)在体外培养条件下无avrA的mRNA转录,且无AvrA蛋白表达。在avrA回复株中,avrAmRNA转录水平约为野生株的2倍,体外培养条件下AvrA蛋白表达量高于野生株;(3)在体外培养条件下avrA的缺失不影响其它炎性相关效应蛋白的转录;(4)C50336△avrA缺失株对小鼠的LDso为6.9×103,野生株与回复株分别为5.0 × 105和2.0 × 105。相较于野生株,C50336△avrA缺失株对小鼠的毒力增强约70倍;(5)C50336△avrA缺失株对肠上皮细胞Caco-2 BBE的侵袭能力显著增强;(6)C50336△avrA缺失株在肠上皮细胞Caco-2BBE中的胞内增殖能力降低。此外,本部分内容还表达和纯化了 AvrA蛋白并制备了 AvrA蛋白的多克隆抗体,Western blot结果显示该多抗具有较高的特异性。构建的pCMV-HA-AvrA及AvrA点突变的pCMV-HA-AvrA(C186A)真核表达质粒,对Caco-2BBE有较高的转染及表达效率。上述结果为进一步研究效应蛋白AvrA对肠炎沙门菌与宿主炎性反应关系提供了基本生物学材料。2.肠炎沙门菌C50336△avrA缺失株体内外感染过程中宿主的炎性反应规律利用沙门菌体外感染人肠上皮细胞Caco-2 BBE模型和链霉素预处理的小鼠体内感染模型,对肠炎沙门菌C50336、C50336△avrA缺失株及回复株在感染过程中宿主炎性反应的基本规律进行了研究。包括对体外感染过程中Caco-2 BBE细胞炎性因子转录水平及培养上清中炎性因子含量的测定,以及感染后对小鼠存活率的测定、体重变化及各脏器带菌情况,并分别于感染后8小时的早期感染点和感染后4天的晚期感染点对小鼠各脏器中炎性因子的转录水平及血清中炎性因子的浓度进行了检测。结果显示,肠炎沙门菌感染Caco-2 BBE 后,IL-1β、COX-2、IL-8、iNOS、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、P62 的转录水平主要在细胞感染早期上调,且以IL-8上调水平最高。IL-17A、IL-4、IL-12β、IL-18、LC3A、LC3B等基因转录水平均有少量上调,但主要在细胞感染晚期。感染后6小时,C50336△avrA缺失株感染组细胞培养上清中IL-6、TNF-α、IL-8、GM-CSF、IP-10、IL-IRα、IL-1β含量显著高于野生株和回复株感染组,而IL-12、IFN-γ、MCP-1含量在沙门菌感染后升高,但在不同菌株感染组之间无显著差异。说明肠炎沙门菌感染可诱导上皮细胞产生快速而强烈的炎性反应,且avrA基因缺失后,肠炎沙门菌诱导宿主炎性反应的能力显著升高。小鼠体内感染结果显示,C50336△avrA缺失株感染后小鼠体重减轻程度及死亡率均高于野生株与回复株感染组,进一步表明avrA基因缺失导致肠炎沙门菌对小鼠的毒力上升。沙门菌感染后小鼠脏器带菌结果显示,小鼠体内脏器带菌量在感染后第3天达到最大值。对感染后8小时和4天脏器带菌量比较结果显示,感染后8小时小鼠肝脏和脾脏内未检测出沙门菌,而在肠道内可检测出大量沙门菌。感染后4天,小鼠回肠、盲肠和肝脏中沙门菌定殖量在不同菌株感染组间无统计差异,但C50336△avrA缺失株感染组小鼠脾脏及结肠带菌量显著高于野生株和回复株感染组。说明avrA缺失后肠炎沙门菌在小鼠体内扩散定殖能力增强。小鼠不同脏器中炎性因子表达水平的检测结果显示,沙门菌感染后8小时的小鼠回肠组织中IFN-γ、IL-1β、IL-10和IL-6转录水平显著升高,且在C50336△avrA缺失株感染组小鼠中转录水平高于野生株与回复株感染组小鼠。沙门菌感染后8小时,小鼠结肠组织中TNF-α、IL-17A转录水平较未感染组显著升高,但在三个不同菌株感染组间无显著差异。感染后4天,iNOS、COX-2转录水平高于未感染组及感染后8小时的水平,但在不同菌株间无显著差异,而IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18和TGF-β1转录水平较未感染组和感染后8小时的水平显著升高,同时在C50336△avrA缺失株感染组小鼠中表达量显著高于野生株与回复株感染组。肠炎沙门菌感染后可诱导小鼠肠道炎症的发生,与体外实验结果一致,avrA缺失后肠炎沙门菌诱导小鼠肠道组织炎性反应的能力增强。此外,沙门菌感染后小鼠结肠组织中炎性因子转录水平变化高于小鼠回肠组织的变化,说明小鼠结肠对于沙门菌的炎性反应性更强。沙门菌感染后4天的小鼠肝脏组织中炎性因子转录水平显著升高,因感染早期沙门菌主要定殖于小鼠消化道,感染后8小时在肝组织中未检测到沙门菌。其中IFN-γ、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2和TNF-α转录水平于沙门菌感染后4天显著升高,且在C50336△avrA缺失株感染组小鼠中表达量显著高于野生株与回复株感染组。沙门菌感染后4天,小鼠脾脏组织中 TNF-a、IL-17A、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-18、iNOS 和 COX-2 转录水平显著升高,在C50336△avrA缺失株感染组小鼠中表达量显著高于野生株与回复株感染组。沙门菌感染后8小时,小鼠血清中炎性因子含量无明显变化。但在感染后4天,血清中GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α、IP-10、KC、MCP-1 和VEGF含量均显著升高,且以上因子在C50336△avrA缺失株感染组小鼠血清中含量高于野生株与回复株感染组。MIG含量在感染后4天高于感染后8小时和未感染组,但在三个不同菌株间无差异。沙门菌感染后不仅诱导肠道局部炎性反应,沙门菌通过肠道屏障后进入其它脏器,也引起小鼠全身性的炎性因子表达,avrA缺失后,导致肠炎沙门菌在小鼠体内的扩散与定殖及诱导小鼠炎性因子产生的能力显著升高。说明肠炎沙门菌效应蛋白AvrA为抑炎分子,它在肠炎沙门菌感染宿主过程中可抑制宿主细胞的过度炎性反应。AvrA缺失后,在小鼠各脏器组织中炎性因子IL-8(IL-6)、IFN-γ、iNOS、IL-1β和IL-18显著升高,提示AvrA可能还参与宿主细胞炎性小体形成与细胞焦亡的发生。上述结果进一步完善和补充了沙门菌与宿主间相互作用关系及宿主炎性反应规律的认识。同时,为进一步揭示效应蛋白AvrA抑炎机制奠定了基础。3.肠炎沙门菌AvrA阻断JNK通路稳定肠上皮紧密连接降低宿主炎性反应在已构建的肠炎沙门菌C50336△avrA缺失株、回复株及沙门菌在体内外感染模型的基本炎性反应规律的基础上,进一步对AvrA在体内外感染过程中所引起的细胞内信号通路的变化及其机制进行了研究。结果显示,肠炎沙门菌感染肠上皮细胞Caco-2BBE后,细胞内 p-JNK、C1eaved-Caspase-3、P53、Beclin-1、Bax、LC3B、P62、ATG16L1、p-P38、p-P65、P65、p-mTOR 表达量显著升高,其中 p-JNK、Cleaved-Caspase-3、P53、Beclin-1、Bax 和LC3B的表达量在C50336△avrA缺失株感染组中显著高于野生株与回复株感染组。细胞凋亡情况检测结果显示,C50336△avrA缺失株感染组细胞凋亡比率显著增高,且主要以Annenxin V阳性PI阴性的早期凋亡细胞为主。Caco-2 BBE细胞转染pCMV-HA-AvrA后,细胞中P-JNK表达量低于空质粒及pCMV-HA-AvrA(C186A)转染组,进一步证实肠炎沙门菌AvrA可抑制JNK磷酸化。肠炎沙门菌C50336△avrA缺失株感染Caco-2 BBE细胞后细胞中P-JNK表达量增高,且显著高于野生株与回复株感染组。同时,紧密连接蛋白ZO-1在C50336△avrA缺失株感染组表达量低于野生株与回复株,而其它紧密连接蛋白,如Occludin、Claudin-1、Claudin-7和黏附连接蛋白E-Cadherin表达量无明显变化。此结果在非极性肠上皮细胞HCT116和极性细胞SKC015细胞系中均得到验证。对ZO-1的mRNA转录水平检测结果显示,肠炎沙门菌对ZO-1蛋白的调节主要发生在转录后调控,而非转录水平调节。对ZO-1的免疫荧光结果显示,沙门菌感染后Caco-2BBE细胞紧密连接蛋白ZO-1结构遭到不同程度破坏,其中C50336△avrA缺失株感染细胞ZO-1无清晰完整的结构,而黏附连接蛋白E-Cadherin未发生明显变化。肠炎沙门菌感染后1-8小时,Caco-2BBE单层细胞TEER值持续下降,其中,C50336△avrA缺失株感染组TEER下降程度较野生株与回复株感染组更大,在感染后2-8小时有显著性差异。ZO-1的免疫荧光结果和TEER结果进一步证实前一部分中avrA缺失导致肠炎沙门菌侵袭量升高的原因主要为肠上皮细胞间紧密连接被破坏。肠炎沙门菌感染后8小时小鼠盲肠即有病理学变化出现,半定量评分结果显示,C50336△avrA缺失株感染组小鼠盲肠出现中度炎症病变,而野生株与回复株感染组小鼠盲肠仅出现轻微炎症,病理学损伤较小。沙门菌感染后4天,avrA感染组小鼠盲肠出现严重组织水肿,大量PMN浸润,杯状细胞基本消失,组织结构完全破坏,为重度肠道炎症病变。野生株与回复株感染组小鼠盲肠也出现较严重的病理损伤现象,但相较于C50336△avrA缺失株组,炎症损伤较轻。C50336△avrA缺失株感染组小鼠结肠上皮细胞中磷酸化的JNK表达量显著高于野生株与回复株感染组,同时,ZO-1表达量降低,与Caco-2BBE的体外试验结果相一致。小鼠肠组织切片的免疫荧光进一步显示,肠炎沙门菌感染后,小鼠结肠上皮细胞中紧密连接和黏附连接结构出现不同程度破坏,其中Claudin-7及E-Cadherin在不同菌株感染组间无明显差异,而ZO-1在C50336△avrA缺失株感染小鼠结肠上皮细胞中无相对完整结构,破坏程度高于野生株与回复株感染小鼠。小鼠肠黏膜层组织的Western blot结果显示,C50336△avrA缺失株感染后8小时小鼠肠上皮黏膜层肠上皮细胞Cleaved-Caspase-3表达量升高。免疫荧光结果进一步发现C50336△avrA缺失株感染后8小时,肠道细胞即可检测到凋亡细胞的出现,而在野生株、回复株感染组与未感染组中未检测到细胞凋亡。肠炎沙门菌感染后4天,肠组织细胞均可观察到凋亡细胞,而相较于野生株与回复株,C50336△avrA缺失株感染组中凋亡细胞数量显著增多。JNK抑制剂预处理的肠上皮细胞感染结果显示,SP600125可抑制C50336△avrA缺失株感染Caco-2 BBE细胞后引起的p-JNK的上调和ZO-1表达量的下降,且JNK抑制剂处理后,细胞培养上清中IL-8含量也相应的降低。说明AvrA通过对JNK信号通路的抑制而稳定肠上皮紧密连接,降低宿主细胞炎性反应。进一步对JNK下游通路的检测结果显示,肠炎沙门菌感染Caco-2 BBE和HCT116后,细胞中p-c-Jun和c-Jun表达量在沙门菌感染后显著增高,且C50336△avrA缺失株感染组细胞中c-Jun的磷酸化水平显著高于野生株与回复株感染组。而FoxO4及磷酸化的FoxO4表达无明显变化。JNK抑制剂可抑制p-c-Jun和c-Jun的表达,但对FoxO4及其磷酸化无显著影响。双荧光报告载体检测AP-1转录活性的结果显示,C50336△avrA缺失株感染的Caco-2BBE和HCT116细胞中AP-1荧光素酶活性均显著高于野生株与回复株,同时SP600125抑制AP-1荧光素酶活性。本部分内容对肠炎沙门菌在体内外感染过程中宿主炎性反应及其机制作了进一步研究,揭示肠炎沙门菌效应蛋白AvrA抑制宿主细胞JNK信号通路,稳定肠上皮细胞紧密连接,从而阻止细菌的侵袭,并降低宿主炎性反应的发生,同时抑制被感染的宿主细胞凋亡。本研究首次在肠炎沙门菌中对效应蛋白AvrA在宿主炎性反应中的功能及具体机制进行研究,同时发现AvrA在肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌对小鼠致病、对细胞内炎性相关的信号通路和对紧密连接调节机制不同。这为肠炎沙门菌感染机制提供了新的认识。