穿孔毒素（Pore-forming toxins,PFTs）是许多致病菌所共有的一种蛋白家族,在致病菌对宿主的致病过程中发挥重要作用。PFTs家族成员通过在宿主细胞膜上形成跨膜孔道结构来引起细胞的裂解。PFTs在细胞膜上形成孔道的过程虽已被熟知,但在该过程中PFTs所依赖的宿主因子及其分子机制还鲜有报道。本研究以PFTs家族中具有强细胞毒性的猪链球菌溶血素（Suilysin,Sly）为代表,利用CRISPR/Cas9技术挖掘介导Sly细胞毒性的宿主因子并探讨其分子机制。另外,PFTs具有良好的免疫原性,是相关致病菌亚单位疫苗的潜在候选者,但是PFTs的细胞毒性作用限制了相关疫苗的开发和利用。本研究以PFTs家族中具有强免疫原性的胸膜肺炎放线杆菌重复毒素（Actinobacillus pleuropenumoniae-RTX-Toxin,Apx）为代表,针对Apx结构蛋白构建了Apx融合蛋白,并评价了其交叉免疫保护效力。具体工作如下:1.CRISPR/Cas9筛选鉴定介导Sly细胞毒性的关键宿主因子研究一是成功筛选验证了7个介导Sly细胞毒性的宿主因子。本研究应用CRISPR/Cas9文库筛选技术在PK15细胞上筛选介导Sly细胞毒性的宿主因子,在获得的候选因子中,通过比对候选因子对应sg RNA的频率及种数,选择7个排名靠前的候选因子（RAB8B、CAMK2B、DOCK9、RASAL1、PTEN、AP2S1及VPS54）进行验证。通过构建敲除细胞系和细胞毒性试验,发现相比PK15,7个候选因子的缺失细胞系对Sly的耐受性均显著提高,其中RAB8B缺失杂合细胞（PK15△RAB8B）对Sly的耐受性最高,提高约5.5倍。二是成功证实RAB8B是介导Sly细胞毒性的关键宿主因子之一。本研究通过有限稀释法获得不表达RAB8B蛋白的单克隆细胞(PK15△RAB8B),通过细胞毒性试验发现,PK15△RAB8B对Sly的耐受性提高约5倍;将1.2μg/m L Sly分别染毒PK15和PK15△RAB8B细胞,镜下观察细胞的形态发现PK15△RAB8B细胞呈大理石状且富有立体感、细胞膜完整并有丰富的绒毛,而PK15细胞拉丝破碎、细胞膜破损且绒毛变少变短,同时间接免疫荧光试验结果显示Sly与PK15△RAB8B细胞的结合低于Sly与PK15细胞的结合。此外,RT-q PCR检测发现Sly染毒PK15细胞后显著增强了RAB8B基因的转录（P＜0.01）。2.RAB8B介导Sly细胞毒性的分子机制研究一是证实RAB8B与Sly互作,但RAB8B并非通过这种互作来介导Sly细胞毒性。本研究表达了RAB8B（aa 1-207）、RAB8B-I（aa 1-110）、Sly（aa 29-497）、Sly-D1-3（aa29-387）、Sly D4（aa 388-497）重组蛋白,免疫沉淀及ELISA试验结果表明,RAB8B与Sly互作,其中RAB8B-I与Sly-D1-3是互作的关键区域;同时构建了RAB8B-I和RAB8B-II（aa 111-207）的真核表达质粒,免疫沉淀试验进一步证实了上述观点;将分别与RAB8B/RAB8B-I重组蛋白预孵育的Sly加入鸡红细胞和PK15细胞中,相关试验结果发现Sly的溶血活性、细胞毒性及其与细胞的结合较对照组均无显著差异;此外,PK15细胞与RAB8抗体预孵育后,发现细胞对Sly的敏感性没有显著改变。二是证实RAB8B通过调控细胞膜可获得胆固醇介导Sly细胞毒性。细胞膜可获得胆固醇是一类能与胆固醇依赖性毒素（Cholesterol-dependent cytolysins,CDCs）结合的胆固醇,而Sly属于CDCs家族。本研究利用检测细胞膜可获得胆固醇的探针—GFP-D4作用于PK15、PK15△RAB8B,结果发现PK15△RAB8B细胞膜可获得胆固醇显著减少。MβCD-cholesterol可增加细胞膜可获得胆固醇,用Sly染毒被MβCD-cholesterol处理的PK15△RAB8B,发现处理后的PK15△RAB8B对Sly的敏感性显著增强（P＜0.001）,且细胞结合的Sly显著增多。这表明RAB8B通过增加细胞膜可获得胆固醇来增强细胞对Sly的敏感性。另外,MβCD可减少细胞膜可获得胆固醇,将Sly分别染毒被MβCD/MβCD-cholesterol处理的PK15,发现MβCD显著降低了细胞对Sly的敏感性（P＜0.001）,并显著降低Sly与细胞的结合。而MβCD-cholesterol显著提高了细胞对Sly的敏感性（P＜0.001）,并显著提高Sly与细胞的结合。表明Sly的细胞毒性依赖于细胞膜可获得胆固醇。三是证实RAB8B通过调控低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）来源胆固醇的转运介导Sly细胞毒性。用LPDS（无脂蛋白的血清）处理PK15和PK15△RAB8B使细胞脂质匮乏,向LPDS处理的细胞中添加LDL用以模拟LDL来源胆固醇在细胞内的转运过程。相关试验结果显示加入LDL后,PK15细胞膜可获得胆固醇显著增加,细胞对Sly的敏感性显著升高（P＜0.001）,Sly与细胞的结合显著增多。而PK15△RAB8B细胞膜可获得胆固醇、细胞对Sly的敏感性及Sly与细胞的结合没有显著差异,说明RAB8B的缺失抑制了LDL来源胆固醇转运到细胞膜来增加细胞膜可获得胆固醇,从而降低细胞对Sly的敏感性。酶联荧光试验结果显示加入LDL后,两种细胞的总胆固醇增量没有显著差异,但是PK15△RAB8B溶酶体胆固醇的增量显著高于PK15,增高约2倍,这说明RAB8B的缺失不影响细胞对LDL来源胆固醇的摄取,但增强了LDL来源胆固醇在溶酶体中的积累。综上表明,RAB8B通过促进LDL来源胆固醇从溶酶体转运到细胞膜来增加细胞膜可获得胆固醇而增强细胞对Sly的敏感性。3.APP Apx融合抗原免疫研究一是成功设计并制备了由外膜囊泡递呈的Apx融合蛋白（Apxr-OMVs）。将大肠杆菌Cly A（909 bp）基因片段和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌Apx I、Apx II、Apx III结构基因片段（Apx IA,651 bp、Apx IIA,594 bp、Apx IIIA,702 bp）共同连入p BAD18-CM载体,再转入大肠杆菌JC8031中诱导表达,通过高速离心收集JC8031重组菌分泌的外膜囊泡。在透射电镜下观察到直径在20-200 nm间的囊泡结构,Western-blot成功检测到与预期分子量一致的Apx融合蛋白条带（约100 k Da）。二是证实Apx融合蛋白（Apxr-OMVs）对APP血清1型和7型具有交叉保护。用Apxr-OMVs免疫小鼠,并对其体液免疫、细胞免疫、攻毒保护率及病理变化进行了评价。结果表明Apxr-OMVs免疫组小鼠产生的特异性Ig G水平、细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）水平及其淋巴细胞增殖水平显著高于PBS组（P＜0.01）。攻毒结果显示Apxr-OMVs对APP血清7型（1516菌株）和1型（2701菌株）分别提供了87.5%和62.5%的保护率。病理切片结果显示,相比PBS组,Apxr-OMVs免疫组小鼠的肺组织病理损伤程度显著降低。综上所述,本研究首次发现宿主因子RAB8B是介导Sly细胞毒性的重要宿主因子之一,并证明RAB8B是通过促进LDL来源胆固醇从溶酶体转运到细胞膜来增加细胞膜可获得胆固醇而增强细胞对Sly的敏感性,这为深入阐明和揭示介导PFTs家族细胞毒性的宿主因子及其分子机制奠定了良好的基础。同时,本研究创新性构建了对APP血清1型和7型具有交叉保护的Apx融合蛋白（Apxr-OMVs）,为PFTs家族相关多价抗原的免疫研究提供了有力的技术支持。