【摘 要】
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目的克隆大鼠海马中Neurogenesin-1(Ng1)基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Ng1真核表达载体,并检测其在cos-7细胞中的表达,为进一步研究该基因对脊髓神经干细胞分化的影响提供
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目的克隆大鼠海马中Neurogenesin-1(Ng1)基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Ng1真核表达载体,并检测其在cos-7细胞中的表达,为进一步研究该基因对脊髓神经干细胞分化的影响提供实验基础。方法①pSecTag2/Hygro B-Ng1真核表达载体的构建及鉴定:在无菌、无RNA酶污染的条件下利用Trizol试剂提取出大鼠海马组织总RNA。利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出Ng1基因片段,电泳分析结束后回收纯化PCR产物,回收产物与空白质粒pSecTag2/Hygro B同时进行XhoⅠ和HindⅢ双酶切,两种酶切产物经T4 DNA连接酶作用后,转化入感受态大肠杆菌JM 109,LB琼脂平板培养过夜。经PCR初筛,阳性克隆行XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果使用BLAST软件与GeneBank数据库进行同源性分析。②cos-7细胞的转染和重组大鼠Ng1蛋白的表达及检测:取纯化的重组质粒pSecTag2/Hygro B-Ng1,在脂质体试剂LipofectamineTM 2000的作用下转染cos-7细胞。转染48h后收集细胞培养液,Western blot鉴定重组Ng1蛋白在cos-7细胞中的表达情况。结果①反转录聚合酶链反应成功获得大鼠Ng1 cDNA。随机挑选10个重组真核表达载体的克隆,聚合酶链反应筛选出阳性克隆2个,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。②脂质体转染cos-7细胞48h后,Western blot鉴定重组Ng1蛋白在cos-7细胞中的表达,在46kD处出现阳性条带。结论大鼠海马Ng1基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Ng1构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Ng1蛋白。
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