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背景和目的糖尿病是一种遗传和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性复杂疾病,并且会导致许多严重的并发症如终末期肾脏病、心血管疾病、失明和截肢。但糖尿病的发病机制尚未完全阐明。目前,全世界的糖尿病患病率迅速增加,发展中国家尤为明显,因此,积极探索糖尿病的发病机制和寻找有效的治疗靶点具有重要意义和现实紧迫性。微小RNA(micro RNAs,miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA分子,参与了多种生理和病理过程。miR-155是一个典型的多功能miRNA。研究提示miR-155在糖脂代谢和调节胰岛素敏感性中可能发挥重要作用。本课题组前期研究发现新诊断T2DM患者血清miR-155水平显著低于对照组,但miR-155在调节糖代谢、胰岛素敏感性和糖尿病发生发展中的具体作用和机制尚待进一步明确。此外,大量研究已证实,miRNA可能在胰岛素作用的靶组织如肝脏、骨骼肌和脂肪中发挥着重要作用。miRNA的异常表达可能影响这些组织的糖脂代谢,与胰岛素抵抗、糖尿病的发生密切相关。因此,为了进一步研究miR-155在血糖调节和胰岛素敏感性中的作用,本课题组拟利用肝脏和骨骼肌过表达miR-155转基因的Rm155LG转基因小鼠解析miR-155对糖代谢和胰岛素敏感性的调节作用。方法:1.Rm155LG转基因小鼠筛选与鉴定及其繁殖传代借助小动物活体成像仪或体视荧光显微镜,检测m RFP表达以筛选和鉴定Rm155LG转基因小鼠,并进行PCR验证。2.利用Rm155LG转基因小鼠,建立骨骼肌过表达miR-155的Rm155LG转基因小鼠利用Rm155LG转基因小鼠,借助小动物活体成像仪检测Rm155LG转基因小鼠与Ckmm-Cre转基因小鼠(为杂合子)交配所生后代的Luc表达,筛选出骨骼肌表达Luc的Rm155LG/Ckmm-Cre转基因小鼠并建系,通过qRT-PCR明确转基因小鼠肌肉miR-155表达水平。3.初步探讨miR-155在糖代谢中的作用1)比较C57小鼠随机、禁食24小时和禁食后重新喂养6小时的血糖差异。2)利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹(Western blot)检测C57小鼠糖代谢相关基因和miR-155的表达。4.利用miR-155转基因小鼠初步探讨miR-155对糖代谢的影响及机制1)利用本研究构建的Rm155LG/Ckmm-Cre转基因小鼠和课题组前期构建的肝脏特异性高表达miR-155小鼠(Rm155LG/Alb-Cre),与对照小鼠,对比腹腔糖耐量(IPGTT)、胰岛素耐量(ITT)和丙酮酸耐受试验(PTT)的差异。2)利用qRT-PCR和Western blot检测Rm155LG/Alb-Cre转基因小鼠糖代谢相关基因表达。结果:1.小动物活体成像仪的检测结果表明,miR-155转基因在Rm155LG/Ckmm-Cre转基因小鼠的骨骼肌上成功被激活。2.C57小鼠空腹血糖显著低于随机和空腹后重新喂养6小时的血糖。qRT-PCR和Western blot结果显示,空腹后肝脏糖异生相关基因如PEPCK,G6PC和PGC-1表达水平显著升高,而miR-155表达水平显著降低,表明miR-155可能与肝脏糖异生相关。3.IPGTT,PTT和ITT结果显示Rm155LG/Alb-Cre转基因小鼠糖耐量和胰岛素敏感性增加,肝脏糖异生能力下降。4.IPGTT和ITT结果显示Rm155LG/Ckmm-Cre转基因小鼠糖耐量和胰岛素敏感性增加。5.Rm155LG/Alb-Cre转基因小鼠肝脏qRT-PCR结果显示,糖异生、糖酵解和三羧酸循环相关基因表达下调。Western blot检测发现肝脏糖异生相关基因表达下调。结论:1.运用Cre/lox P系统,在Rm155LG/Ckmm-Cre转基因小鼠上实现了骨骼肌组织特异性高表达miR-155转基因的激活。2.利用肌肉和肝脏组织特异性过表达miR-155转基因小鼠初步证实了高表达miR-155可提高小鼠胰岛素敏感性、改善小鼠葡萄糖耐量,抑制糖异生,提示miR-155可能是糖尿病一个新的治疗靶点。