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Resistin称抗素(也称FIZZ3),是一种含有114个氨基酸的细胞因子。近来发现resistin具有一系列前炎症因子的特征,在炎症中能够诱导血管内皮细胞粘附分子的表达,从而导致白细胞向各个炎症组织中的浸润。尽管resistin在炎症发生中已有不少报道,但其与经典炎症信号途径的关系,在炎症中的作用及其调控机制尚未阐明。
环氧合酶2(COX-2)是前列腺素合成中的一个限速酶。在人体中存在两种不同的COX异构体,分别称为COX-1和COX-2。其中COX-2是一种经过诱导而产生的酶,在正常生理条件下维持较低的表达水平,但在炎症部位表达上调,催化炎性PGs的合成并诱发炎症反应。此外,COX-2的启动子上存在NF-kB的结合元件,可受转录因子NF-kB调控。一些重要的炎症因子例如TNF-α和IL-1可通过激活NF-kB而上调COX-2的表达。
本研究以resistin为研究对象,采用real-time PCR、Western Blotting和细胞转染等技术,系统研究了resistin通过经典的炎症信号途径上调COX-2的基因表达及抗炎肽C15对resistin等引起的炎症反应的抑制作用分子机制,结果如下:
1.在巨噬细胞内分别转染猪和小鼠resistin的超表达载体,采用real-timePCR和Western Blotting方法检测细胞内源的COX-2的mRNA和蛋白质水平的表达变化。结果表明,resistin在RAW264.7巨噬细胞系中可以显著地上调COX-2的mRNA和蛋白质的表达。更重要的是,通过原核表达制备了抗resistin的抗体,用抗体处理可以抵消resistin的这种作用。
2.以巨噬细胞为模型,通过负显性IkBα突变体和PDTC这两种抑制物质研究了resistin对COX-2的信号转导途径的调控。结果表明,无论是超表达负显性Ird3α突变体载体,还是用抑制剂PDTC刺激,都可以抑制resistin对COX-2的诱导作用。进一步的研究证实,resistin的超表达可以上调NF-kB分子中的p65亚基的表达,进而诱导COX-2的表达水平的上升。
3.以resistin对小鼠巨噬细胞作不同时间梯度的处理,用Western Blotting方法分析resistin对一种MAPKKK激酶TAK1(Transforming growth factorβactivatedkinase1)的磷酸化程度的影响。结果表明,resistin可以显著上调TAK1的磷酸化水平。
4.以促炎物质resistin,LPS,PA分别和C15共同处理小鼠巨噬细胞,检测炎症基因COX-2和iNOS(inducible nitric oxide synthase)的表达变化。结果表明,炎症基因COX-2和iNOS可以被三种促炎物质诱导表达,并且这种诱导的情况可以显著被C15所抑制住。
5.在巨噬细胞中,以LPS在不同时间梯度刺激细胞,用细胞免疫荧光的方法检测NF-kB的p65亚基的入核情况。结果证实,C15可以明显抑制LPS所导致的p65的入核情况,表明C15是通过阻止NF-kB的p65亚基入核,从而抑制相关炎症因子的表达,进而表现出一定的抗炎活性。