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目的意义：以髓系白血病细胞株（HL60、K562、HL60/ADR、K562/ADR）、AML原代细胞、白血病荷瘤鼠及Tg(fli:EGFP)斑马鱼为体内外研究模型，系统研究黄酮对白血病细胞生长抑制、诱导凋亡、与阿霉素联合的协同增敏机制以及抗血管新生的作用机制，从而全面深入探讨黄酮治疗白血病的可行性。实验方法与结果第一部分：黄酮及联合阿霉素在体外对髓系白血病细胞增殖凋亡影响方法：CCK8法测白血病细胞株HL60、K562、HL60/ADR、K562/ADR对黄酮和阿霉素的IC20值及单药和联合用药后对白血病细胞株和AML原代细胞的生长抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；光镜下观察细胞形态变化。结果：四种细胞株单用黄酮以及联合阿霉素IC20值浓度，12h、24h、48h后细胞存活率明显下降，并呈时间和浓度依赖(P<0.05)，两药联合对细胞的生长有相加和协同作用；细胞凋亡率明显上升，并随浓度而变化。正常人单个核细胞加入黄酮后，对细胞的生长没有影响。5例初发AML患者，加入黄酮后，细胞的生长明显抑制，并呈时间和浓度依赖。第二部分黄酮及联合阿霉素诱导髓系白血病细胞凋亡的作用机制方法：采用基因芯片技术，分析加入黄酮后四种细胞株信号通路的变化。用Western blot及流式细胞仪，对黄酮及联合阿霉素作用细胞株及AML原代细胞24h和48h后细胞凋亡相关信号通路及白血病耐药蛋白变化进行检测。结果：加黄酮前后四种细胞株凋亡信号通路及调控血管新生因子通路发生变化。黄酮及联合阿霉素作用四种细胞株24h和48h后Rh123阴性的细胞数明显增加。黄酮作用后可出现caspase-3和caspase-8的剪切，联合用药作用更为明显，caspase显著激活。抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降，Bcl-xL蛋白下调，促凋亡蛋白Bim、Bad、Bax明显增加。磷酸化的P-P38MAPK及P-JNK蛋白表达水平明显升高，而P-ERK蛋白明显下降。黄酮及联合用药后24h和48h，K562/ADR中MDR及HL60/ADR中MRP1蛋白发生变化，48小时更为明显。第三部分黄酮及联合阿霉素对髓系白血病荷瘤鼠体内的作用研究方法：使用BALB∕c雄性裸小鼠，建立HL60荷瘤鼠模型。分为四组：未加药组、黄酮组、阿霉素、黄酮联合阿霉素组，腹腔注射药二周。每周二次测量荷瘤鼠体重及肿瘤大小，采用ELISA方法检测荷瘤鼠注射药物前后血中IgM情况。荷瘤鼠处死后取出肿瘤，中性甲醛固定，做免疫组化。结果：接种HL60细胞2x107，成瘤率100%，平均成瘤时间14天左右。各组荷瘤鼠给药后发现，阿霉素组以及联合用药组，体重有明显的下降，移植瘤体积明显缩小。黄酮组用药后荷瘤鼠体内IgM明显升高，与用药前有显著差异(P<0.01)。瘤块免疫组化，发现用药组有明显促进细胞凋亡，可见凋亡小体；caspase显著激活；Bcl-2、Bcl-XL表达明显下降，Bim、Bad、Bax明显增加；磷酸化的P-P38MAPK及P-JNK表达明显升高，而P-ERK明显下降。第四部分黄酮在体内外对抗血管新生的作用机制方法：在HL60细胞中加入不同浓度的黄酮，采用qRT-PCR检测血管新生因子VEGF，VEGFR1，VEGFR2，Notch1，Delta like4基因表达变化；同时提取细胞蛋白，Western blot检测。使用本实验室已构建Tg(fli1:EGFP)斑马鱼系，取14hpf斑马鱼胚胎，加黄酮后24h和48h，用倒置荧光显微镜同步进行血管表达量检测；提取各组标本14hpf，38hpf(加药后24h)和62hpf(加药后48h)的总RNA，用qRT-PCR技术，分别检测血管新生因子表达。在荷瘤鼠模型中，瘤块做血管新生因子免疫组化。结果：HL60细胞加黄酮后VEGF, VEGFR2,DLL4基因明显下调(P<0.01)，VEGFR1Notch1也下降(P<0.05)；VEGFR2, DLL4和Notch1蛋白表达明显下降，VEGF和VEGFR1在48h蛋白表达也轻度下降。荷瘤鼠的免疫组化，发现用药组明显抑制肿瘤组织VEGF、VEGFR1、VEGFR2,、DLL4和Notch1表达。Tg(fli1:EGFP)斑马鱼加入黄酮溶液后，24hpf及62hpf可见血管网明显稀疏、中断，走向紊乱，有较多的血管新生芽，未能发育为完整的背部节段血管(ISVs)。不同浓度黄酮组抑制Tg(fli1:EGFP)斑马鱼VEGF、VEGFR2、Notch1和DLL4基因的表达，并呈剂量依赖性。结论：黄酮能明显抑制白血病细胞株和AML原代细胞的生长，与阿霉素联合作用抑制更明显，呈协同或相加效应，并诱导白血病细胞凋亡。黄酮能使白血病细胞凋亡信号通路及调控血管新生因子通路发生变化。黄酮联合阿霉素对白血病细胞的凋亡，其机制是通过线粒体跨膜电位的下降，caspase的活化，调控Bcl-2家族蛋白的表达，下调ERK细胞保护通路并上调JNK及P38MAPK应激相关通路而共同起作用，并在荷瘤鼠体内得到验证。黄酮有增加裸鼠体内的体液免疫功能，提升血清中的IgM。同时黄酮及联合阿霉素后，能逆转K562/ADR以及HL60/ADR耐药蛋白的表达。黄酮在HL60细胞株中有抗血管新生因子的作用，同时在活体Tg(fli1:EGFP)斑马鱼以及HL60荷瘤鼠模型中也被证实。