磺酰脲除草剂是近二十年来开发出的高效、广谱、对哺乳动物低毒、高选择性除草剂,用量一般不超过100g/hm2。磺酰脲除草剂是一种乙酰乳酸合酶(AHAS)抑制剂,通过抑制植物中合成支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的关键酶AHAS的活性抑制三种氨基酸的合成,达到抑制蛋白合成,阻止杂草生长。2007年全球磺酰脲除草剂商的销售额达到了 20.35亿美元,占全球除草剂市场的11.0%,仅次于草甘膦。大部分磺酰脲除草剂呈弱酸性,在酸性条件下易水解。但是在中性和碱性的条件下部分磺酰脲除草剂稳定性较好在土壤中的降解速率非常慢,在土壤中的半衰期达一年之久。土壤中的残留磺酰脲除草剂会对后茬敏感作物产生药害,影响农田的轮作,造成重大损失。环境中残留磺酰脲除草剂还会对水生生态环境产生潜在的威胁以及其他环境问题。磺酰脲除草剂在环境中的残留和降解越来越成为关注的焦点。研究表明,微生物的降解作用是环境中磺酰脲除草剂残留降解的主要途径。近些年报道了大量磺酰脲除草剂降解菌株,但是对磺酰脲除草剂在微生物体内降解途径、微生物降解磺酰脲除草剂的关键酶及其编码基因的研究还不够深入。Hansschlegelia zhihuaiae S113是本实验室分离保存的一株磺酰脲除草剂高效降解菌,可以降解噻吩磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆等含有酯结构的磺酰脲除草剂。通过液相色谱-质谱联机(HPLC-MS/MS)检测发现,菌株S113的粗酶液可以噻吩磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆、苄嘧磺隆、胺苯磺隆等含有酯结构的磺酰脲除草剂转化相应的无除草活性的酸的形式。磺酰脲除草剂同样可以抑制细菌的AHAS活性。E.coli DH10B中表达的AHAS I对AHAS抑制剂不是太敏感,而对AHAS抑制剂敏感的AHAS Ⅱ由于发生了移码突变不表达,这导致E.coliDH10B对AHAS抑制剂有中等强度的抗性。本研究通过回复突变E.coli DH10B的ilvG基因构建了E. coliDH10B(ilvG+),在含有0.2 g·L-1Val的基础培养基平板上,由于Val抑制了对AHAS抑制剂敏感性较差的AHAS的活性,E. coli DH10B(ilvG+ )对大部分AHAS抑制剂非常敏感,大部分AHAS抑制剂可以在较低的浓度抑制E.coliDH10B (ilvG+ )的生长。E.coli DH10B( ilvG+ )可以被用来筛选AHAS抑制剂去活性基因的文库。菌株S113的水解酶可以把噻吩磺隆转化为噻吩磺酸,噻吩磺酸对E. coli DH10B(ilvG+ )的MIC大于1200 μM是噻吩磺隆的MIC的300多倍。采用SDS高盐结合CTAB法从菌株S113中提取高质量的染色体总DNA,用鸟枪法构建了 3-6kb的总DNA的基因组文库。在含有0.2g·L-1 VaL, 50 μM噻吩磺隆的基础培养基平板上用E.coli DH10B (ilvG+ )筛选文库,从大约15,000个转化子中筛选到1个具有噻吩磺隆水解酶活性的阳性克隆子。用软件分析及亚克隆的方法,确定了编码磺酰脲除草剂水解酶(SulE)的1,194bp长结构基因sulE,该基因编码398个氨基酸,G+Cmol%含量为51.09%。SulE含有信号肽,信号肽的切割位点在第37位Ala和第38位的Glu之间,去除信号肽的SulE含有361个氨基酸。通过sulE基因序列的Blast比对,发现在基因水平上无任何同源序列;在氨基酸水平上,发现其具有α/β水解酶家族的一个假定保守区,与一些推定的α/β水解酶最高同源性也只有37%,与来自已经报道功能的Alcaligenes中的酯酶731只有29%的同源性。通过比对发现SulE含有具有α/β水解酶家族蛋白的典型三联体催化活性位点Ser245-His369-Glu268,但是在催化位点的Ser周围没有α//β-水解酶家族特征序列(Gly-X1-Ser-X2-Gly),因此推测SulE为α/β-水解酶折叠蛋白家族中的一个新成员。以pET29a为载体,构建表达质粒pET29a-sulE,实现了 SulE蛋白在Ecoli BL21中的融合表达,并用镍离子亲和层析柱对融合蛋白SulE实现了纯化。SulE是一个同源二聚体,每个亚基大小为41.5 KD,等电点(pI)为8.3。SulE的最适pH为7.5,在pH 6到pH 9的范围内SulE比较稳定,缓冲液中处理1 h后SulE的相对酶活力仍保持85%以上。SulE的最适反应温度为40℃,SulE在45℃处理1 h后仍保持85%。1 mM的Ag+、Cd2+、Zn2+和表面活性剂SDS、2.0 mM甲胺磷、0.5 mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF,组氨酸变性剂DEPC以及疏基试剂pCMB和碘乙酰胺都能强烈的抑制SulE的活力。1.0 mM的Ni2+能抑制大约40～50%的酶活力。10 mM的金属离子螯合剂EDTA和Tween 80对酶抑制作用小于10%。SulE能水解芳环上含有酯结构的磺酰脲除草剂,对这些除草剂均有较高的催化效率。对噻吩磺隆的催化效率最高,Km为0.0184 mM,Kcat为19.1 S-1, kcat/Km为1041 mM-1·s-1,是对其他磺酰脲除草剂的催化效率的10-20倍。对甲磺隆、胺苯磺隆、苄嘧磺隆等芳环结构相同的除草剂的催化效率相似,说明SulE的催化效率与磺酰脲除草剂的三嗪环和脲桥结构关系不大。对芳环为噻吩环的噻吩磺隆的催化效率较高和对芳环部分为苯甲酸二酯的氯嘧磺隆的催化效率较低说明SulE的催化效率与芳环的结构以及酯的结构有关。同时测定了 SulE对不同链长的对硝基苯酚羧酸酯的水解速率。SulE对对硝基苯酚乙酸酯的水解速率最高,并且其催化效率随着羧酸链的增长而下降,对羧酸链达到6个碳原子的羧酸与对硝基苯酚形成的酯则没有酶活。说明SulE更倾向于水解短链羧酸酯。通过同源重组的方法插入失活了菌株S113中的sulE基因,菌株S113和菌株S113ΔsulE在基础培养基中的生长状况相同,说明sulE对菌株S113在基础培养基中的生长影响不大。菌株S113可以在48h代谢完200 μM 噻吩磺隆,在72 h代谢84.4%50 μM的甲磺隆,而菌株S113ΔsulE则完全不能代谢噻吩磺隆和甲磺隆,甲磺隆和噻吩磺隆对菌株S113AsulE有强烈的抑制作用,这说明SulE是菌株S113中代谢磺酰脲除草剂的唯一的酶,SulE通过代谢含有酯结构的磺酰脲除草剂赋予了菌株S113对这些除草剂的抗性。通过在Scerevisiae BY4741中表达SulE, S. cerevisiae BYsulE可以在48 h完全转化噻吩磺隆和88.1%的甲磺隆,同时S.cerevisiae也获得了噻吩磺隆和甲磺隆的抗性,这说明SulE可以在真核生物酵母中表达显示活性,并赋予酵母磺酰脲除草剂抗性。sulE在构建磺酰脲除草剂抗性作物方面有巨大的应用前景。将sulE克隆到枯草芽孢杆菌分泌表达载体pP43NMK上构建了质粒pP43sulE,通过转化导入原养型的B.subtilis BS36,构建了能够降解磺酰脲除草剂的工程菌B.subtilis sulE。用其修复含有0.1 mg·kg-1甲磺隆的土壤30 d后,土壤中的甲磺隆未检出小于1μg·kg-1,修复效果比原始菌株S113提高了60%。