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目的: 本课题拟从细胞水平探索白藜芦醇对于卵巢癌细胞生物学特性的影响,包括增殖、迁移、侵袭、凋亡,并探索其对于不同卵巢癌细胞系的IC50药物浓度,进一步揭示白藜芦醇对于卵巢癌细胞糖酵解的影响,分别从基因、蛋白水平验证白藜芦醇的抗肿瘤作用及其可能机制并从动物实验模型角度验证了其抗肿瘤效果。 方法: 1、采用MTT法检测梯度浓度的白藜芦醇(25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM)对于人卵巢癌A2780/SKOV3细胞的增殖抑制作用并计算白藜芦醇对于卵巢癌细胞系的IC50用于后续实验,检测白藜芦醇对于人正常卵巢上皮细胞(IOSE-80)和肺上皮细胞(BEAS-2B)的毒性作用。 2、采用细胞划痕及Transwell实验检测白藜芦醇对于人卵巢癌A2780和SKOV3细胞迁移、侵袭能力的影响。 3、流式细胞仪检测白藜芦醇作用于A2780和SKOV3细胞24h、48h及72h后,两细胞系的凋亡率变化情况。 4、葡萄糖氧化酶法和乳酸氧化酶法检测白藜芦醇对于卵巢癌细胞糖酵解的影响。 5、qRT-PCR检测200μM/100μM白藜芦醇分别作用于A2780/SKOV3细胞48h后细胞中AMPK、mTOR和Caspase3mRNA的表达水平。 6、Western blots检测白藜芦醇以及Compound C共培养卵巢癌细胞A2780/SKOV3细胞72h后AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和Cleaved Caspase3、Caspase3蛋白的表达情况,以GAPDH为内参蛋白。 7、SKOV3细胞建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,分别予以腹腔注射白藜芦醇溶液(100mg/kg)和溶剂(10%乙醇),对比两组肿瘤大小、重量及肝肾、肿瘤的HE染色及Ki-67免疫组化染色。 结果: 1、梯度浓度的白藜芦醇对于卵巢癌A2780和SKOV3细胞皆有抑制增殖作用,并呈浓度依赖关系,但白藜芦醇对于正常细胞抑制作用较弱。 2、划痕实验及Transwell实验结果显示白藜芦醇显著抑制A2780和SKOV3细胞迁移和侵袭。 3、流式细胞仪结果显示白藜芦醇作用于A2780和SKOV3细胞后,细胞凋亡率增加,并呈时间依赖关系(F=143.557,P<0.001;F=86.121,P<0.001)。 4、200μM/100μM白藜芦醇作用于A2780/SKOV3细胞12h后,上清葡萄糖消耗量减少,乳酸生成量减少(均P<0.01); 5、200μM/100μM白藜芦醇分别作用于A2780/SKOV3细胞48h后,荧光定量PCR显示AMPK和Caspase3表达量增加,而mTOR表达量降低(均P<0.05)。 6、白藜芦醇作用于A2780/SKOV3细胞72h后,细胞中p-AMPK和CleavedCaspase3蛋白条带灰度增加,而p-mTOR蛋白条带变细、灰度降低。而CompoundC(10μM,AMPK特异性抑制剂)与白藜芦醇共培养卵巢癌细胞72h后,细胞活力高于白藜芦醇单独处理组,且细胞中p-AMPK和Cleaved Caspase3蛋白条带灰度较白藜芦醇组降低,而p-mTOR蛋白条带灰度较白藜芦醇组灰度增加(均P<0.05)。 7、白藜芦醇组裸鼠皮下移植瘤生长速度显著低于对照组(F=36.443,P<0.001),皮下移植瘤重量低于对照组(t=2.940,P=0.019),且Ki-67评分显著低于对照组(t=6.843;P<0.001)。 8、对照组裸鼠4例出现卵巢癌肝脏转移,而白藜芦醇治疗组仅1例出现肝脏转移,两组转移指数分别为2.2和0.4(P=0.038)。 结论: 1、白藜芦醇呈浓度依赖性抑制人卵巢癌A2780和SKOV3细胞增殖并促进其凋亡,但与A2780相比,SKOV3对于白藜芦醇更为敏感,提示不同卵巢癌细胞系对于白藜芦醇的敏感性具有差异。 2、白藜芦醇抑制人卵巢癌A2780和SKOV3细胞迁移和侵袭。 3、白藜芦醇可抑制人卵巢癌细胞A2780/SKOV3糖酵解。 4、白藜芦醇对于卵巢癌细胞的促凋亡作用可能与激活AMPK基因及蛋白的表达进而抑制下游mTOR基因及蛋白的表达相关。 5、白藜芦醇对于荷卵巢癌裸鼠移植瘤具有抑制生长及肝转移作用,且无明显肝肾毒性。