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中华鲟(Acipenser sinensis)、长江鲟(Acipenser dabryanus)、白鲟(Psephuyrus gladius)是长江流域特有的鲟鱼,其中白鲟已宣告灭绝,中华鲟、长江鲟也处于不同程度的濒危状态。虽然人工繁殖有突破,但随着养殖规模的扩大,中华鲟、长江鲟在养殖过程中主要受到细菌性疾病的困扰,然而我们对抵御这些病原菌的免疫反应所涉及的分子机制知之甚少,也为鲟鱼的保护研究增加了一定的难度。作为国家保护动物,中华鲟、长江鲟资源数量较少,能作为科研用鱼更是有限。细胞系是研究免疫基因和免疫机制的有效途径之一,本研究针对上述问题,首先开展了中华鲟脾脏、肾脏和长江鲟鳍条组织细胞系的建立工作,在此基础上,对长江鲟免疫相关基因TLR1、TLR4和NK-Lysin、cathelicidin两种抗菌肽的克隆与表达模式进行了研究。取得的结果如下:(1)鲟细胞系的建立本研究分离培养了三种鲟组织细胞,能够连续传代,其中中华鲟脾脏组织细胞达到25代、肾脏组织细胞达25代、长江鲟鳍条组织细胞到67代。简要摸索了鲟细胞最适培养条件,其适宜温度为25℃,最佳培养基为M199。细胞的成功培养为后续相关实验开展提供了宝贵的材料,进一步达到保护鲟鱼资源的目的。(2)长江鲟TLR1和TLR的克隆与表达模式TLR(Toll-like receptor,Toll样受体)是硬骨鱼天然免疫系统中一类重要的PRR(pattern recognition receptor,模式识别受体)。然而关于TLRs的信息在最原始物种长江鲟中报道较少。本研究利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了长江鲟TLR1和TLR4的全长基因。获得的TLR1全长2957bp,编码767个氨基酸,TLR4 c DNA全长2902bp,编码830个氨基酸。TLR1和TLR4都有几个典型的TLRs基序,包括信号肽、富含亮氨酸重复序列(LRR)基序、跨膜结构域和TIR基序。此外,TLR4在其TIR基序中含有3个保守域,参与TLRs信号转导。在TLR4中还发现了一个对识别哺乳动物TLR4的LPS很重要的脯氨酸。并分析了TLR1和TRL4的理化特性。实时荧光定量PCR结果显示,两种转录本均在11种正常组织中普遍表达,但表现出不同的表达模式,其中TLR1在心脏中高表达,TLR4在皮肤中高表达。此外,TLR1和TLR4基因在LPS和Poly I:C刺激后在头肾白细胞中表达上调,表明这两个基因都参与了长江鲟对LPS和Poly I:C的免疫应答,为进一步阐明鱼类TLRs的配体特异性和信号转导途径提供了基础。(3)Cathelicidin、NK-Lysin两种抗菌肽的克隆与表达模式抗菌肽(AMPs)是许多物种天然免疫反应的保守成分。在本研究中,从长江鲟中克隆了两个AMPs(分别为1576和606 bp)的c DNA序列。系统发育分析表明,这两个AMP与其他鱼类的同源蛋白序列聚在一起。NK-Lysin在胚胎发育早期高表达,表明存在母源表达。组织分布分析表明,cathelicidin在肝脏中表达最高,NKLysin在脾脏中表达最高。Poly I:C处理后,cathelicidin在诱导后12小时和24小时表达上调,而在72小时表达下调,NK-Lysin表达增加,在24小时达到高峰。LPS处理后,在6、24、48小时明显上调cathelicidin的表达,在6、12小时显著上调NK-Lysin的表达。这些结果提示,两种AMPs可能参与了Poly I:C或LPS刺激诱导的免疫应答。