目的:建立两步基因检测法初筛RhD阴性标本的方法,为血液中心及相关机构大量筛查真正RhD阴性及RhD变异体提供快速准确的检定方法。　　 方法:血清学常规试管法进行初筛后,用序列特异性引物多聚酶链反应(SSP-PCR)对初筛阴性标本进行两步法基因检测分型,并用INNO-TRAIN试剂盒进行结果比较,对有突变位点的变异体进行基因测序。　　 结果:第一部分235例初筛阴性样本中,检测到1-10外显子全缺失137例,2-9外显子缺失20例,1227G>A突变63例,845G>A突变4例,3-6外显子缺失2例,3G>A突变1例,8-9外显子缺失一例,另有一例3-10外显子缺失为首次报道。以上标本经INNO-TRAIN试剂检测或基因测序结果完全符合。　　 第二部分试剂盒的应用中,40例血清学检定为部分D弱D或者为DEL的标本经本试剂盒检测,有10例为阴性、DEL1227G>A22例、弱D15有3例,部分Dtype3有3例,DEL3G>A1例,经测序另有1例为弱D24。　　 结论:本文所建立的两步法适用于筛查RhD真正阴性及变异体。方法经济实用、简洁可靠,准确。两步基因检测法适用于各大血液中心及基层血站检测初筛RhD阴性的供血者及临床确认RhD阴性患者。