毕赤酵母是一种可以利用甲醇为唯一碳源进行生长代谢的甲基营养型酵母。甲醇在过氧化酶体中氧化成甲醛,经同化途径固定在胞内,或在细胞质中经异化途径完全氧化成CO2释放到胞外。本课题在毕赤酵母中构建了CRISPR Cas9系统,对异化途径的相关基因进行逐一敲除,比较了敲除菌与GS115在葡萄糖和甲醇培养下的表型、转录组和代谢组间差异,利用GO分析和KEGG通路分析,挖掘和解析了影响甲醇利用的相关基因和途径,主要研究结果如下:（1）利用CRISPR Cas9系统,本课题成功构建了甲醛脱氢酶敲除菌株（Δfld）、s-羟甲基谷胱甘肽水解酶敲除菌株（Δfgh）和甲酸脱氢酶敲除菌株（Δfdh）。以甲醇为主要碳源时,Δfld、Δfgh和Δfdh的OD600生长率分别低于GS115的60.98%、23.66%和5.69%,GS115生长水平显著优于Δfld和Δfgh。（2）比较转录组结果与表型一致。FLD不仅参与甲醇代谢,还参与有机氮代谢和酰胺生物合成。FGH重生GSH,辅助FLD供给能量,并促使甲醛和过氧化氢代谢。FDH主要影响了胞内酸代谢,如醛酸、羧酸及各类氨基酸等。比较转录组结果显示,FLD敲除造成了ABC转运体、氨基酸的生物合成、蛋白质消化吸收的差异。（3）多组学分析发现,异化途径被阻断后,同化途径转录下调,关键代谢物D-葡萄糖-6-磷酸和甘油醛下调,随之中心碳代谢下调,导致甲醇无法有效地固定为生物质。同时氧化磷酸化显著下调,线粒体酶亚基活性降低,ATP供应不足,遗传复制过程受到影响。上述两方面可能是敲除菌株生物量低的主要原因。（4）甲醛不仅与谷胱甘肽复合,还与DNA和蛋白质反应。FLD的敲除促进氨基酸代谢和蛋白质消化吸收。甲醛暴露下,谷胱甘肽和氨基酸上调,促使甲醛复合。蛋白酶体和自噬的转录上调,用于消化甲醛诱导的DNA-蛋白质交联。本研究结合表型,多维度研究了异化途径缺失菌株在甲醇代谢过程中的多基因转录水平和小分子代谢差异,解析了异化途径与同化途径的作用关系,为深入了解异化途径阻断对胞内代谢网络的影响提供理论基础。