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目的构建携带HSV1-TK和BDNF的重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF和重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,分别将其转染体外培养的大鼠BMSCs,探讨不同载体对BMSCs的转染效率、转染细胞的增殖能力和向神经元样细胞诱导分化能力、两目的基因的表达相关性,以及转染报告基因(HSV1-TK)的BMSCs对131I-FIAU的体外摄取。为下一步选择合适的载体活体监测转基因BMSCs治疗脑梗死提供实验基础。方法1.不同重组载体的构建和SD大鼠BMSCs的培养及鉴定1.1.重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及鉴定根据Gene bank上的CDs区,设计并合成HSV1-TK、IRES、BDNF的全长扩增引物,并在引物两端加入与真核质粒表达载体pcDNA3.1+的多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)相对应的酶切位点。应用聚合酶联反应(polymerase chain reaction,PCR)技术分别从重组质粒pcDNA3.1-TK、pIRES-EGFP中扩增获得TK和IRES的cDNA序列；用RT-PCR技术从1周龄SD大鼠脑组织中提取、扩增BDNF的cDNA序列。对上述目的基因全长片段进行双酶切后,依次插入到经过相对应酶切的质粒载体pcDNA3.1+的MSC中,每一步得到的重组质粒均经过酶切鉴定,最后进行序列分析。1.2.重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的构建及鉴定以含巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)启动子的表达质粒pDC316-EGFP为载体,将偶联基因TK-IRES-BDNF插入MCS,构建重组腺病毒表达质粒载体pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP。以pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP为重组表达质粒,与重组腺病毒(Adenovirus, Ad)骨架质粒共转染293T细胞,包装生成腺病毒重组体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,以Ad5-EGFP为对照病毒。本研究部分与上海鸣宏生物有限公司合作完成。1.3.SD大鼠BMSCs的培养及鉴定分离4-6周健康SD大鼠股骨和胫骨,用含15%胎牛血清的DMEM-F12培养基冲出骨髓液,密度梯度离心后,接种于塑料培养瓶中,培养出的BMSCs连续传3-4代,细胞纯化后,倒置显微镜下观察细胞形态,并通过免疫细胞化学检测表面抗原CD44和CD34的表达。2.不同载体转染BMSCs的实验研究2.1.不同载体对BMSCs转染效率的测定在相同转染条件下,用脂质体介导重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-EGFP转染BMSCs,在绿色荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorenscent protein, EGFP)的表达时间和表达阳性率,间接反映脂质体介导重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF对BMSCs的转染效率和表达时间。重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在不同转染复数(multiplicity of infection, MOI)下转染BMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达时间和表达阳性率。2.2.不同载体转染BMSCs后细胞增殖能力、向神经元样细胞分化能力的检测不同重组基因载体转染BMSCs后,在不同时间内,倒置显微镜下观察细胞形态和密度变化,MTT比色法检测转染细胞的增殖能力。对转染重组腺病毒的BMSCs加入碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF),不同时间下在倒置显微镜下观察细胞形态变化,检测转染细胞向神经元样细胞的分化能力。2.3.不同载体转染BMSCs后目的基因表达的检测重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs后用RT-PCR检测TK基因的转录,Western blot检测BDNF蛋白的表达；不同MOI的重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs后,实时定量聚合酶联反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction, RQ-PCR)和2-△△CT方法分析两目的基因HSV1-TK与BDNF的相对表达量(CT),并进行相关性分析；Western blot检测并分析HSV1-TK与BDNF的蛋白水平表达。3.131I-FIAU的标记及BMSCs转染不同载体后对131I-FIAU的摄取3.1.131I-FIAU的标记及质量鉴定利用Iodogen固相氧化法对FAU进行放射性碘标记,标记产物用Sep-Pak-C-18反相层析色谱小柱进行纯化及标记率分析,TLC-SG硅胶板薄层层析法测定标记产物的放射化学纯度,并观察131I-FIAU在37℃正常人新鲜血清中放置4h、12h和24h后的体外稳定性。3.2.不同载体转染BMSCs后对mI-FIAU的摄取研究不同载体转染BMSCs 48h后,加入纯化后的131I-FIAU,在不同时间分别计数细胞培养基上清液中的放射性计数和消化后细胞的放射性计数,细胞摄取结果为：摄取率=C细胞悬液/(C细胞悬液+C细胞培养基)×100%。第一组实验,重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs 48h后,加入纯化后的131I-FIAU。在一定观察时间内,分析转染重组质粒的BMSCs对131I-FIAU的摄取数值随时间的变化,以转染质粒pcDNA3.1+为对照组。第二组实验,在MOI分别为O、50、100、150、200、250转染BMSCs 48h后,加入纯化后的131I-FIAU。在相同时间下分析不同MOI的重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs对131I-FIAU的摄取研究。第三组实验,结合上述实验不同MOI的重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP对BMSCs的转染效率,MTT对增殖能力的分析结果,不同MOI的重组腺病毒在相同时间下对131I-FIAU的摄取结果。以最佳MOI的重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs,分析转染重组腺病毒的BMSCs对131I-FIAU的摄取数值随时间变化的关系,以转染无效病毒Ad5-EGFP为对照组。4.统计学方法数据分析采用SPSS11.0软件进行,线性相关采用Pearson分析,两样本均数比较采用双侧t检验,以P＜0.05为有统计学意义。结果1.不同重组载体的构建和SD大鼠BMSCs的培养及鉴定1.1.重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及鉴定重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF经PCR、酶切和序列分析鉴定与预期设计一致。1.2.重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的构建及鉴定由上海鸣鸿生物有限公司协作构建的重组表达质粒pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP经PCR、酶切鉴定和测序鉴定与预期设计一致；包装生成的重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的活病毒数量达到2.0×1010 PFU (plaque formation unit)/ml,对照重组腺病毒Ad5-EGFP的活病毒数量为3.6×1010PFU/ml。1.3.大鼠BMSCs的培养及鉴定采用密度梯度离心法获得到的BMSCs传到3-4代后,可获得较高纯度和保持良好的增殖能力；细胞免疫化学鉴定,CD44在95%以上的BMSCs表面表达,而CD34则未见明显表达。2.不同载体转染体外培养的BMSCs实验研究2.1.不同载体对BMSCs转染效率的测定以阳离子脂质体(μl)与重组质粒载体(μg) pcDNA3.1-EGFP在2.5：1时转染BMSCs,48h时EGFP有较高表达效率,在随后的观察时间内EGFP的表达开始下降；不同MOI的重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs后,绿色荧光显微镜下观察,在24h开始表达EGFP,48h达到高峰,120h开始下降；MOI为150时在转染效率可大于90%。2.2.不同载体转染BMSC后细胞增殖能力、向神经元样细胞分化能力的检测不同载体转染BMSCs后,在一定时间内于倒置显微镜下观察。发现重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs后细胞密度明显减低,有较多细胞漂浮,台盘兰染色证实为死亡细胞。而重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的MOI为250时转染BMSCs后,在观察时间内细胞形态和密度均无明显变化,细胞培养基中仅可见极个别漂浮细胞。MTT比色法亦证实重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP对BMSCs的毒性作用较小, MOI在150时细胞存活率仍大于98%。重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs的同时在细胞培养基中加入bFGF和EGF,倒置显微镜下观察细胞形态变化,发现转染重组腺病毒组和未转染重组腺病毒组的BMSCs均保持向神经元样细胞的良好分化能力,两组相比无明显差别。2.3.不同载体转染BMSCs目的基因表达的检测重组真核质粒表达载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs 48h后,通过RT-PCR技术可检测到HSV1-TK的表达,Western blot检测到BDNF的表达。不同MOI的重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs后,通过RQ-PCR检测到两目的基因的表达,并且随着病毒MOI的增加表达增强。HSV1-TK和BNDF两目的基因的表达有良好的线性相关(r=0.973, p<0.05, n=3)。Western blot亦检测到了HSV1-TK和BNDF两目的基因的表达,随着病毒MOI的增加,基因表达也在增加。3.131I-FIAU的标记及不同载体转染BMSCs后对131I-FIAU的摄取研究3.1.131I-FIAU的标记及质量鉴定Iodogen固相氧化法能有效标记FAU；经测定,标记物的标记率为(64.35±4.89)%(n=5)。TLC-SG硅胶板层析法测定,131I-FIAU的放射化学纯度为(98.62±0.62)%(n=5).131I-FIAU在正常人血清中37℃中孵育24h后,放射化学纯度仍大于95%。3.2.不同载体转染BMSCs后对131I-FIAU的细胞摄取研究第一组实验,重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs后对131I-FIAU的摄取研究,以转染质粒pcDNA3.1+为对照组。重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs 48h后,加入纯化后的131I-FIAU,分析5h内对131I-FIAU的摄取。研究发现在前3h随着时间的延长摄取增加,在3h对131I-FIAU的摄取达到平台期,值为(4.15±0.074)%,n=3,在随后的观察时间内摄取数值增加不明显。在各个观察时间点转染目的质粒组与对照质粒组对131I-FIAU的摄取数值相比,有统计学意义(t=9.29-232.75,p<0.05,n=3)。第二组实验,MOI分别为0、50、100、150、200、250的重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs后,分析相同时间对131I-FIAU的细胞摄取。不同MOI的重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs 48h后,在同一时间点3h时分析转染细胞对131I-FIAU的摄取。研究发现重组腺病毒随着MOI的增加对131I-FIAU的摄取增加,在MOI为150时达到平台期,随后随着MOI的增加转染重组腺病毒的BMSCs对131I-FIAU摄取增加不明显。第三组实验中,相同MOI重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs后,分析转染BMSCs不同时间对131I-FIAU的摄研究,以转染对照病毒Ad5-EGFP为对照组。结合上述转染效率、MTT等实验结果,确定重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的MOI为150时是对BMSCs最佳转染效率。MOI为150转染BMSCs 48h后,加入纯化后的131I-FIAU,分析不同时间转染重组腺病毒的BMSCs对131I-FIAU的摄取研究。结果发现在前3h内,转染了重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs随着时间的延长,其摄取131I-FIAU也在增加,在3h摄取数值可达(31.42±0.46)%(n=3),此后随着时间的延长,摄取数值增加不明显。在观察时间内各时间点转染重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs对131I-FIAU的摄取均显著高于对照组,两组相比具有统计学意义(t=23.06-173.83,P<0.05,n=3)。结论本研究通过体外比较携带报告基因HSV1-TK和治疗基因BDNF的不同载体转染BMSCs实验研究,证实重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP是一种可以携带较大容量碱基,对BMSCs有较高转染效率,转染重组腺病毒后的BMSCs仍保持良好的增殖能力和向神经元样细胞诱导分化能力,IRES介导上游报告基因的表达可间接反映下游治疗基因的表达,二者具有良好的线性相关。利用Indogen固相氧化法对FAU进行放射性核素131I标记,标记产物用Sep-Pak-C-18反相层析色谱小柱进行纯化,是一种简单的标记及纯化技术,可得到较高的放射化学纯度。重组腺病毒载体Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP转染BMSCs可表达有活性的HSV1-TK,能有效介导BMSCs摄取131I-FIAU,在一定的MOI范围内其摄取数值随着MOI的增加而增加,有明显的剂量依赖性；此外,在一定的观察时间内随着时间的延长,对131I-FIAU的摄取数值亦在增加,显著高于对照组。本研究为后续以重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP为载体介导的放射性核素报告基因活体监测踪转基因BMSCs治疗脑梗死的干细胞有效归巢数量、分化和功能表达过程,以及对外源基因的表达部位和时间的活体评估奠定了良好的实验基础。