细胞增殖与凋亡失衡是肿瘤形成和发展的一个重要机制,而肿瘤细胞的凋亡受阻也是导致其疗效减低的重要原因。细胞凋亡的调控机制非常复杂,涉及多种调节因子和多条反应途径。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族就是一类重要的抗细胞凋亡因子,该家族结构的共同特点是N端含有一个或多个串联的杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat, BIR),C端含或不含有一个环指(RING finger)结构。Survivin是新近发现的IAP家族中的一个重要成员,它不仅具有强大的抗细胞凋亡功能,而且在人类多种恶性肿瘤中均存在高表达。近年来的研究表明survivin与包括宫颈癌在内的多种人类恶性肿瘤的形成、发展及预后有着密切关系,其表达异常升高可能是导致肿瘤放疗抵抗和化疗耐药的重要原因。RNAi(RNA interference)技术是双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的序列特异性的转录后基因沉默,广泛存在于高等植物和动物中,其机制是细胞内的dsRNA被Dicer(一种RNA酶Ⅲ)剪切成双链的小分子干涉RNA (small interfering RNA,siRNA)与RNA诱导的基因沉默复合物结合,降解与之互补的靶mRNA,特异性抑制靶基因表达。自1998年研究者们发现dsRNA能引起特异性基因沉默以来,RNAi技术因其简便易行并且具有特异性和高效性,很快成为研究基因功能和基因表达调控的重要方法。宫颈癌是妇科高发恶性肿瘤,虽然我国对宫颈癌的防治已取得很大成效,但近年来随着人乳头状瘤病毒(HPV)感染率的上升和社会生活的变化,宫颈癌的发病率呈有增高趋势,近20年来发病明显趋于年轻化,且宫颈腺癌比例增加。因为腺癌易早期发生淋巴结转移,对放疗的敏感性较差,对化疗容易产生耐药,因此治疗难度加大,预后不理想。因而寻找一种科学、可行的途径来增强放、化疗疗效,改善预后成为宫颈癌治疗领域研究的热点问题。研究目的观察survivin基因表达下调对宫颈癌凋亡和放、化疗敏感性的影响,并通过寻找其可能作用途径,探讨survivin基因RNAi对宫颈癌放、化疗增敏的可行性,为以survivin为靶基因治疗宫颈癌提供理论依据。研究方法本研究主要分以下三个部分:①Survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌HeLa细胞survivin表达的影响。根据survivin基因编码序列及RNAi寡核苷酸设计原则,设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(S1-1,2、S2-1,2),退火连接后利用DNA重组技术将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后经脂质体转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达,筛选干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体和稳定转染细胞系进行后续实验。②Survivin基因RNAi对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡及放、化疗敏感性的影响。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期变化,流式细胞仪、Hoechst染色观察细胞凋亡情况,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3(caspase-3)活性变化,免疫荧光检测Ku70蛋白表达变化。平板克隆形成实验、多靶单击模型拟合细胞存活曲线观察细胞放疗敏感性变化;流式细胞仪、MTT比色法检测2GyX线照射24h、48h和72h后细胞凋亡和生长抑制情况。MTT比色法检测细胞存活率并计算顺铂作用72小时的50%抑制浓度(IC50);流式细胞仪、MTT比色法检测5ug/ml顺铂作用后24h、48h和72h后细胞凋亡和生长抑制情况。③Survivin基因RNAi对宫颈癌HeLa细胞裸鼠成瘤、移植瘤生长及其放、化疗敏感性的影响。直接细胞悬液接种法建立HeLa-S2、HeLa-NC、HeLa-U6 neo和HeLa 4种细胞的宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤情况,比较4种细胞的成瘤能力。定期测量移植瘤体积并绘制生长曲线,处死后称取移植瘤瘤重,观察survivin基因RNAi对移植瘤的生长抑制。免疫组化SP法检测各组移植瘤survivin蛋白表达情况。免疫组化SP法检测FⅧRag表达情况,并计算微血管密度(microvessel density,MVD)。HE染色、TUNEL染色检测各组移植瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡指数(apoptotic index,AI)。通过定期测量移植瘤体积并绘制生长曲线,处死后称取移植瘤瘤重,TUNEL染色检测移植瘤细胞凋亡情况,观察survivin基因RNAi对移植瘤X线放射治疗敏感性和顺铂化疗敏感性的影响。研究结果①成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-S1和pSilencer2.1-S2;建立了4组稳定转染细胞系:HeLa-S1、HeLa-S2、HeLa-NC和HeLa-U6 neo。②转染pSilencer2.1-S1和pSilencer2.1-S2的HeLa细胞中survivin mRNA和蛋白表达均呈现不同程度下调,pSilencer2.1-S2的干涉效果较好,其稳定转染细胞系HeLa-S2 survivin mRNA和蛋白表达明显下降,表达抑制率分别为:62.8%和60.1%。③HeLa-S2细胞增殖受到抑制,各检测点A值显著下降(P<0.05);细胞周期发生显著变化,细胞被阻滞于G0/G1期,占(72.7±3.1)%,G2/M期明显减少,占(5.1±2.9)%;细胞凋亡率为:(19.2±1.4)%,明显升高。④HeLa-S2 caspase-3激酶活性增强,A405达1.26±0.04;Ku70蛋白表达明显下降。⑤各组细胞克隆形成率随X线照射剂量升高而下降;同一剂量照射下,HeLa-S2克隆形成率显著降低,细胞存活曲线显示:HeLa-S2 D0、Dq值显著下降,分别为:3.15、1.21,其放射增敏比分别为:2.01(D0值比)、1.77(Dq值比);2Gy X线照射后细胞凋亡率和生长抑制率随时间延长显著增加,各检测点HeLa-S2细胞凋亡率和生长抑制率明显高于未转染HeLa细胞。⑥各组细胞存活率随顺铂药物浓度升高而下降;在同一药物浓度下,细胞存活率明显下降,顺铂作用72小时的IC50值为(0.74±0.02)ug/ml;5ug/ml顺铂作用后细胞凋亡率和生长抑制率随时间延长显著增加,各检测点HeLa-S2细胞凋亡率和生长抑制率明显高于未转染HeLa细胞。⑦成功建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种HeLa-S2组裸鼠成瘤较晚,且肿瘤生长缓慢,其平均成瘤时间为(21.33±0.51)天,与接种HeLa组裸鼠[(7.22±0.37)天]相比差异显著(P<0.05)。⑧接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积在每个检测点均明显小于接种HeLa组;观察结束时,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:(0.369±0.043)g和(1.150±0.136)g(P<0.05)接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤生长抑制率为:67.9%。⑨免疫组化结果显示:接种HeLa-S2组裸鼠survivin蛋白表达显著下降;接种HeLa-S2组裸鼠FⅧRag表达亦显著下降,MVD值降至23.38±3.14。HE染色、TUNEL染色结果显示:接种HeLa-S2组裸鼠细胞凋亡明显增多,AI值达(22.73±1.37)%。⑩X线放疗后不同检测点接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:( 0.407±0.056 ) g和(1.381±0.289)g(P<0.05);接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:(30.06±0.98)%和(4.17±0.64)%(P<0.05)。(11)顺铂化疗后不同检测点接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:( 0.323±0.058 ) g和(1.347±0.173)g(P<0.05);接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:(37.38±1.01)%和(5.19±0.61)%(P<0.05)。结论①Survivin基因RNAi可成功阻抑人宫颈癌HeLa细胞中survivin mRNA和蛋白表达。②Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。③Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,调节细胞周期分布,使细胞阻滞于G1期,并下调Ku70蛋白表达水平,降低DNA损伤修复能力,进而显著提高细胞对X线放射治疗的敏感性。④Survivin基因RNAi可增加X线照射诱导的细胞凋亡,增强放射治疗对细胞的生长抑制。⑤Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,增强caspase-3激酶活性,诱导细胞凋亡,并显著提高细胞对顺铂化疗的敏感性。⑥Survivin基因RNAi可增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对细胞的生长抑制。⑦Survivin基因RNAi可通过抑制HeLa细胞增殖降低其成瘤能力。⑧Survivin基因RNAi可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达降低其MVD,从而抑制移植瘤生长并促进其凋亡。⑨Survivin基因RNAi可增加X线放射治疗诱导的细胞凋亡,增强放射治疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤的放疗敏感性。。⑩Survivin基因RNAi可增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤的化疗敏感性。