胃癌是一种极具侵略性的肿瘤,是全球癌症相关死亡的第三大原因。据近年来的流行病学数据分析,胃癌的高发地主要集中的东亚的一些国家,比如中国,日本等,而在中国,每年因胃癌死亡的人数占全球胃癌死亡人数的45%。由于早期胃癌病人缺乏一些特异的症状,往往确诊的时候已经是胃癌晚期。随着一些新的早期诊断疗法的研究开发,目前胃癌的早期诊断率有所提高,但是胃癌病人的预后差,死亡率高的现状并没有得到根本扭转。这也就迫切的需要更深一步的研究胃癌发生发展的分子机制和胃癌病人的临床特征,为胃癌的诊断和个性化治疗提供理论依据。近年来,表观遗传学在肿瘤发生发展过程中的调控作用引起广泛的研究。组蛋白去甲基化酶1(LSD1)是首个被发现的组蛋白去甲基化酶,属于单胺氧化酶类,能够特异性的去除组蛋白H3第四位和第九位赖氨酸上的单双甲基和许多非组蛋白的甲基化修饰。研究表明LSD1在多种肿瘤细胞中高表达,LSD1的小分子抑制剂或者靶向LSD1的siRNA可抑制肿瘤细胞的生长和转移。TGF β1(Transforming growth factorβ1,转化生长因子β1)是EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition,上皮细胞-间质细胞转化)的主要诱导者,能够促进肿瘤的转移和增殖。我们前期的研究已经报道了 LSD1抑制剂通过上调N-Cadherin并下调E-Cadherin的表达抑制胃癌细胞MGC-803的转移和侵袭,而这两个钙黏蛋白恰恰是TGF β1的下游调控蛋白。因此我们猜测,LSD1和TGF β1共同调控着胃癌细胞的转移并可能有着相互作用。本课题的研究内容主要包括:1.LSD1和TGF β1在胃癌组织中的表达量及二者的相关性分析。我们将收集的235例胃癌病人的癌组织和癌旁组织制成组织切片,然后进行LSD1和TGFβ1的免疫组化染色,通过对这些组织临床病理特征及LSD1和TGF β1表达量的分析显示,在收集的胃癌组织中,发生远端转移的占63.4%,同时Sβearman相关性分析结果显示在发生远端转移的胃癌组织中,LSD1和TGF β1两种蛋白的表达呈现明显的正相关,在未转移的胃癌组织中,LSD1和TGF β1的表达无明显相关性。除去5例高分化的病例,在低分化和中分化的胃癌组织内,LSD1和TGFβ1的表达均呈明显的正相关。基于这些分析结果,我们猜测在胃癌细胞内,LSD1和TGF β1之间可能会有相互调控作用并且影响着胃癌细胞的转移过程。具体的调控作用和调控机制需要进一步的证实。2.在胃细胞内TGFβ1对LSD1的调控作用研究。人重组TGFβ1作为外源性生长因子分别作用于人胃癌细胞系MGC-803,HGC-27和SGC-7901,均能够显著上调不同胃癌细胞内LSD1的表达,但是却不影响正常胃粘膜上皮细胞GES-1内LSD1的表达量。同时,在荷瘤小鼠的瘤体内,TGF β1也能明显上调LSD1的表达。该实验结果表明TGF β1对LSD1的调控表现出明显的胃癌细胞选择性。3.TGFβ1调控LSD1表达的机制研究。我们首先检测了 TGFβ1的SMAD通路,TGF β1激活SMAD2/3使其磷酸化,当SMAD3的抑制剂SIS3被加入后,能阻断细胞内TGFβ1对SMAD3的激活作用,但是TGF β1和SIS3同时处理细胞并不影响TGFβ1对LSD1的上调作用。接着我们又检测了 TGF β1非经典调控信号因子ERK1/2和NF-κB,结果显示,TGF β1诱导ERK1/2和NF-κB的磷酸化激活并促进NF-κB的入核。分别使用ERK1/2和NF-κB的抑制剂tangeretin和BAY 11-7085或者siRNA失活ERK1/2或者NF-κB,同时再加入TGF β1处理细胞MGC-803发现,TGF β1诱导LSD1表达量上调的作用被抑制。p300的ChIP实验结果表明TGF β1激活NF-κB的入核,促进p300对LSD1的转录调控。双荧光素酶报告基因检测结果表明ERK1/2、NF-κB和p300抑制剂使TGFβ1激活LSD1基因启动活性的作用被抑制。综上,TGF β1-ERK1/2-NF-κB-β300顺序激活调控着LSD1基因转录。在GES-1细胞内,TGF β1失活ERK1/2和NF-κB,抑制NF-κB的入核,从而不能激活LSD1的启动子活性,对LSD1表达量无调节作用。4.LSD1对TGF β1的调控作用研究。我们构建了基于CRISPR/Cas9系统的LSD1低表达慢病毒载体,成功建立了 LSD1低表达的稳转细胞系。ChIP实验结果表明在MGC-803细胞内,LSD1的Knock-down能够增加TGF β1启动子区H3K9me2水平,从而抑制TGF β1基因的转录,减少细胞培养基内TGF β1的分泌量。在LSD1 Knock-down的MGC-803稳转细胞的荷瘤小鼠瘤组织及胃癌转移组织内,LSD1和TGF β1的表达呈正相关,与EMT相关蛋白E-Cadherin的表达呈负相关,与N-Cadherin及Vimentin呈正相关。转录组测序的结果显示,LSD1 Knock-down组与对照组胃癌细胞内,差异表达基因318个,KEGG注释结果发现TGF β信号通路和多个与肿瘤增殖和转移相关的信号通路,该结果进一步说明LSD1对胃癌细胞的转移有着重要的调控作用。5.LSD1调控胃癌转移的作用机制研究。TGF β1通过诱导胃癌细胞内基质金属蛋白酶MMP2和波形蛋白Vimentin及N-Cadherin的表达,同时抑制E-Cadherin的表达,促进肿瘤细胞的转移。相反,在MGC-803细胞内,LSD1的低表达对这些蛋白有着相反的调控作用,能够抑制胃癌细胞的转移。值得注意的是,LSD1的低表达可抑制TGFβ1对上述蛋白的调节作用,进而阻断TGFβ1对胃癌细胞转移的促进作用,同时,体内肺转移小鼠模型的研究发现,LSD1低表达可抑制胃癌细胞系MGC-803的体内肺转移过程,延长小鼠生存期。因此我们得出结论,LSD1介导了 TGF β1对胃癌细胞转移的促进作用。6.雌激素对胃癌转移的调控作用研究。基于胃癌发生率的性别差异和LSD1在核受体介导的肿瘤增殖和转移过程中的功能报道,本课题研究发现,雌二醇E2能够抑制胃癌细胞MGC-803的转移,但是对细胞的增殖没有影响。有趣的是,E2能够下调LSD1的表达,免疫共沉淀实验结果显示,E2激活ERα与LSD1的结合。在蛋白酶体抑制剂MG-132存在时,E2使LSD1的泛素化增加。LSD1的低表达可逆转E2对胃癌细胞转移的促进作用。综上,本课题通过临床样本分析发现LSD1与TGF β1在转移型及中低分化的胃癌组织中表达呈正相关。细胞水平的机制研究表明,TGF β1-ERK1/2-NF-κB-β300依次激活调控着LSD1基因转录和蛋白的表达,同时LSD1能够通过调节TGF β1启动子附近H3K9me2的量调节TGF β1的转录和表达。而LSD1和TGFβ1在胃癌细胞内形成的旁分泌增强环路,诱导细胞发生EMT过程,促进肿瘤细胞转移。但在胃粘膜上皮细胞GES-1中,TGF β1可失活ERK1/2从而不能上调LSD1的表达。同时在胃癌转移病人的癌组织内LSD1和TGF β1的表达呈正相关,与EMT相关蛋白E-Cadherin的表达呈负相关,与N-Cadherin及Vimentin呈正相关。利用Cas9技术将LSD1基因敲除后能够在体外、体内通过下调TGF β1表达,调节E-Cadherin、N-Cadherin等EMT相关蛋白的表达,抑制肿瘤细胞的EMT过程,从而抑制肿瘤转移。此外,E2诱导ERα与LSD1结合促进LSD1的泛素化降解,抑制胃癌细胞的转移。本研究首次发现了 LSD1与TGF β1在胃癌病人中表达的相关性及其对胃癌细胞EMT过程的促进机制,初步探索了 LSD1在雌激素抑制胃癌细胞转移中的调控机制,为以LSD1为靶点的抗肿瘤药物研发及胃癌的个性化治疗提供了理论支持。