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新型合成酚类抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)通过生产和消费进入环境,对人体健康和生态环境造成影响。目前,其安全性仍存在很大争议,而我国尚无食品中TBHQ的标准检测方法。基于“绿色化学”的环境保护理念,为从源头对其进行控制,满足当前对食品中TBHQ添加量进行检测监督的需求和进一步完善TBHQ的毒理学评价,本研究建立了定量检测食用植物油中TBHQ的方法,研究了TBHQ在大鼠血清中的代谢规律,运用血清药理学方法对TBHQ进行了毒性评价。论文取得的主要成果如下:
(1)建立了能够快速、准确、灵敏地检测食用植物油中TBHQ的液相色谱/质谱联用法。该方法线性好(R<2>=0.9990),检出限低(0.3 mg/kg),准确度高(回收率83.3~110.8%),重现性好(日内相对标准偏差为2.5%,同问相对标准偏差为7.6%),耗时短。应用该方法对市场上常见食用植物油进行检测,TBHQ浓度为0~87.7 mg/kg,低于国家规定的最大使用量200 mg/kg。
(2)TBHQ经大鼠体内代谢后,在血清中检测到游离型TBHQ和四种代谢物。利用TBHQ 二级质谱主要特征碎片离子m/z 149,在大鼠血清中检测到TBHQ。通过一级质谱总离子流图和提取离子流图的对比分析,鉴别出四种代谢物。通过多级质谱分析,以特征碎片离子为依据,鉴定出TBHQ的葡萄糖醛酸型结合物和硫酸型结合物,另外两种代谢物结构中均含有TBHQ-硫酸型结合物的部分。
(3)建立了定量分析大鼠血清中TBHQ以及半定量分析大鼠血清中TBHQ代谢物的液相色谱/质谱联用法,检测了不同剂量、不同时间TBHQ及其代谢物在血清中的浓度,运用实用药代动力学软件3P97对TBHQ及其代谢物在大鼠血清中的代谢过程进行了动力学模型计算。TBHQ及其代谢物M1、M2、M3、M4在体内的代谢过程都符合一级吸收速率的二室模型。TBHQ在血液中吸收快、分布快、消除较慢;其代谢物迅速在体内生成,除TM2Pb,血液中M1、M3、M4很快达到峰值,代谢物的分布速度与TBHQ一样快,但消除速度要比TBHQ更为缓慢。
TBHO在大鼠体内的代谢存在性别差异。除了低剂量组,中剂量组和高剂量组中雄性大鼠血清中TBHO及其代谢物的总浓度均显著高于雌性(P<0.01);除TBHQ和M2外,低、中、高剂量组中雄性大鼠血清中M1、M3和M4的浓度均显著高于雌性大鼠(P<0.01)。此外,运用Power模型对TBHQ及其代谢物在体内的暴露浓度与剂量之问的关系进行了探讨,结果表明:剂量增高时,TFBHQ在大鼠体内的暴露浓度以高于与剂量呈正比的方式增大,而代谢物M1、M2、M3、M4的体内暴露浓度则以低于与剂量呈正比的方式增大。
(4)采用MTT比色法,以人正常肝细胞HL-7702为对象,对TBHQ进行了血清毒理学评价。含代谢物血清的细胞毒性很低;TBHQ在低浓度(0.01~0.30mM,12 h培养;0.01~0.20mM,24 h培养;0.01~0.10 mM,48 h培养)时的细胞毒性很低,只有在高浓度时才明显抑制细胞增殖;当细胞培养时间延长时,TBHO对肝细胞的半致死浓度降低,细胞培养12 h、24 h和48 h时,可造成肝细胞半数致死的TBHQ浓度分别为0.50~0.80mM、0.30~0.40 mM、0.15~0.20 mM。因此,在国家卫生标准规定的使用范围内,食品抗氧化剂TBHQ不具有明显毒性。
本文的研究结果为TBHQ国家标准检测方法的建立提供了重要的参考价值,对揭示TBHQ在体内的代谢途径、代谢规律有着重要的理论意义,进一步补充了TBHO的毒理试验数据,为其安全性评价提供了重要依据。