胆管癌作为少见的消化道恶性肿瘤由于其特殊的解剖关系及生物学特征。虽发病率低，但手术难度大，切除率低。且传统放、化疗效果不佳，远期疗效极差。为此国内外许多学者就其发病机制及治疗开展了深入广泛的研究。现代观点认为肿瘤是一种细胞周期病，众多的癌基因、抑癌基因改变与细胞的生命活动异常，最终都可以汇聚到细胞周期的调控异常上来。依赖细胞周期蛋白激酶（CDKs），作为调节细胞周期进行的中心分子与Cyclin（细胞周期蛋白）超家族形成活性复合体，在细胞周期的正调节起决定性作用。而抑癌基因及其诱导产生的细胞周期蛋白激酶抑制蛋白（CDKIs）通过抑制CDK的活性，对细胞周期的进行负调控。这些抑制剂中，作为近年来发现的一个多功能CDKIs，P27^kip1的研究特别受重视。P27^kip1的重要性在于：P27^kip1被称为一个中央信号调节者，分布于G1期大部分时期，协调胞外环境各种输入信号。如一道闸门，或使细胞通过G1期进入S期，或令其退出周期，在G1期细胞周期蛋白/周期蛋白激酶复合物的调节中起重要作用。因此，P27^kip1通过阻止细胞G1/S期转换的“关卡”而参与细胞周期的调控，P27^kip1表达异常将使本来应该停止增殖或生理凋亡的细胞不停地进入细胞周期，而造成恶性增生。目前，在多种恶性肿瘤中均发现有P27^kip1表达异常，且其在肿瘤组织中低表达被认为是预后不良及高侵袭性的重要指标。Skp2作为泛素蛋白酶体途径中SCF复合体底物特异性识别序列，因能泛素化降解P27^kip1，因而也与肿瘤的发生、发展关系密切。胆管癌中是否也存在同样P27^kip1表达异常，且P27^kip1与Skp2在胆管癌形成中的作用，国内外尚未见报道。化疗药物通过作用在细胞繁殖的不同环节，抑制或杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗的目的，已成为当今临床治疗肿瘤的重要手段。随着抗肿瘤药物的广泛应用，耐药性成为临床肿瘤化疗失败最常见和最难克服的问题，尤其是有些肿瘤对某些药物可能本身就存在固有耐药。其中最重要的原因就是与某些基因扩增及其表达产物异常相关。目前胆管癌的化疗效果很不令人满意，化疗反应率只有20％～30％，且联合化疗并不能显著提高其疗效。P27^kip1作为重要的细胞周期抑制因子，同时是许多药物抗肿瘤作用中的关键靶分子，在化疗药物诱导的细胞凋亡过程中起到十分重要的作用。其表达异常与大多数肿瘤对化疗的耐受有关。是否P27^kip1表达异常在胆管癌化疗敏感性中存在某种联系?在手术切除、化疗、放疗基础上，肿瘤的基因治疗已经成为一个新的治疗或辅助治疗的发展领域。目前基因治疗已广泛地应用于治疗肝癌、胰腺癌、结肠癌等，并初步显示出了广阔的临床应用前景。本研究课题着眼于探讨P27^kip1与Skp2在胆管癌组织中的表达与意义，明确其在胆管癌发生，发展中的作用及可能的机制；并通过引入外源性P27^kip1基因，探讨以P27^kip1为靶点的基因治疗在胆管癌治疗中的可行性；进一步研究了P27^kip1通过恢复和重建G1/S关卡，定向调控细胞周期协同特定细胞周期化疗药物，在胆管癌化疗化疗增敏中的作用及可能的机制。为基因治疗胆管癌提供一定的实验理论依据。第一部分：P27^kip1和Skp2在胆管癌组织中的表达及临床意义论文1：P27^kip1在胆管癌组织中的表达与临床病理特征的相关性研究论文2：Skp2在胆管癌组织中的表达与临床病理特征的相关性研究目的F-box蛋白Skp2参与细胞周期抑制蛋白P27^kip1泛素化降解，研究发现Skp2在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达增加。本研究旨在探讨Skp2和P27^kip1在胆管癌组织中的表达及与胆管癌各项临床病理特征的关系，并探讨两者的相关性。方法用免疫组化链霉素抗生物素-过氧化物酶复合物法（SP法）检测Skp2和P27^kip1蛋白在43例胆管癌组织标本及10例伴慢性胆管炎的胆管壁组织组织中的表达情况。结果1．在胆管癌中的Skp2蛋白阳性率为34.88％（15/43）显著高于伴慢性炎症的胆管组织中阳性率0％（0/10）（P＜0.05）。2．Skp2蛋白表达与胆管癌的分化程度，肿瘤分期显著相关（P＜0.05）3．P27^kip1在胆管癌组织中的阳性率为：30.23％（13/43），而伴慢性炎症的胆管组织中阳性表达率为：80.00％（8/10），差异有显著性（P＜0.05）。4．P27^kip1蛋白表达与胆管癌的分化程度以及临床分期呈显著相关（P＜0.05）。结论1．胆管癌组织中存在P27^kip1蛋白与Skp2蛋白表达异常。Skp2和P27^kip1蛋白表达异常与胆管癌的发生、发展密切相关。2．胆管癌组织中存在Skp2介导的泛素蛋白酶降解途径异常，P27^kip1蛋白异常低表达可能正是异常增强的Skp2介导泛素-蛋白酶体途径降解的结果。3．检测Skp2和P27^kip1的表达对胆管癌的早期预测有一定的参考价值。第二部分：P27^kip1和SKP2在胆管癌细胞株QBC₉₃₉中表达的相互关系的研究论文3：腺病毒介导的P27^kip1过表达对胆管癌细胞株QBC₉₃₉中SKP2表达的影响论文4：反义SKP2对胆管癌细胞株QBC₉₃₉中P27^kip1表达的影响目的探讨重组腺病毒介导的187位突变的P27mt基因及S期激酶相关蛋白（SKP2）反义寡核苷酸（ASODN）分别转染QBC₉₃₉细胞，以观察它们分别对胆管癌细胞QBC₉₃₉中SKP2和P27^kip1表达的影响，明确SKP2调控P27^kip1的降解机制及泛素-蛋白酶体途径在胆管癌发生发展中的作用。方法通过携带人突变P27^kip1基因的重组腺病毒载体转染P27mt到人胆管癌细胞株QBC₉₃₉；SKP2反义寡核苷酸和胆管癌细胞QBC₉₃₉共培养，脂质体转染。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），Western Blot法检测SKP2和P27^kip1 mRNA和蛋白在胆管癌细胞QBC₉₃₉中的表达。结果Ad-P27mt作用与胆管癌细胞QBC₉₃₉后，SKP2、P27^kip1在mRNA和蛋白水平表达较空载体Ad-LacZ组及空白对照组均显著增强（P＜0.05）。SKP2 ASODN作用于胆管癌细胞QBC₉₃₉后，SKP2在mRNA和蛋白的表达较对照组和NSODN组均显著降低（P＜0.05），P27^kip1 mRNA表达无明显差异（P＞0.05），蛋白表达则较对照组和NSODN组明显增高，差异显著（P＜0.05）。结论1．胆管癌细胞QBC₉₃₉中存在泛素化蛋白酶体降解途径异常增强。2．SKP2介导的泛素-蛋白酶体途径异常增强在调节胆管癌细胞QBC₉₃₉中P27^kip1的降解中发挥重要作用，P27^kip1是Skp2的泛素连接酶主要的下游效应物，胆管癌细胞QBC₉₃₉中Skp2高表达，P27^kip1低表达可能是泛素-蛋白酶体途径异常增强作用的结果；而阻断该降解途径，P27^kip1表达显著升高。3．SKP2反义寡核苷酸通过阻断泛素-蛋白酶降解途径，能够显著抑制QBC₉₃₉细胞中SKP2 mRNA和蛋白的表达，并促进P27^kip1蛋白表达，而对P27^kip1 mRNA无明显影响，提示Skp2对P27^kip1的调节主要在转录后水平。4．Ad-P27mt感染胆管癌细胞QBC₉₃₉后，QBC₉₃₉细胞中SKP2及P27^kip1 mRNA和蛋白的表达均显著升高，提示过表达的P27^kip1对SKP2存在正反馈调节机制。SKP2的表达受转录及转录后双重调节。5．P27^kip1羧基端的Thr-187是Skp2特定的结合域。该位点突变，可显著降低Skp2介导的泛素化—蛋白酶对P27^kip1的降解。6．Skp2和P27^kip1作为胆管癌基因治疗中有效的潜在靶基因，在胆管癌的基因治疗方面具有重要意义。第三部分：重组腺病毒载体介导的人P27^kip1基因体内、体外外治疗胆管癌的实验性研究论文5：腺病毒介导的突变型P27^kip1对胆管癌细胞QBC₉₃₉体内、体外增殖的影响论文6：P27^kip1基因在人胆管癌细胞化疗增敏效应中的作用目的探讨外源性突变型P27^kip1高表达，在体内和体外对人源性胆管癌细胞增殖及凋亡的影响及引入外源性P27^kip1在人胆管癌细胞株QBC₉₃₉中高表达，对胆管癌细胞化疗敏感性的影响。方法通过携带人突变P27^kip1基因的重组腺病毒载体Ad-P27mt和重组腺病毒Ad-LacZ，转染人胆管癌细胞株QBC₉₃₉，逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和Western Blot，检测P27^kip1在胆管癌细胞株中mRNA和蛋白的表达水平；四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）、克隆形成试验及流式细胞术（FCM），检测P27^kip1过表达对胆管癌细胞生长抑制、细胞周期和凋亡的影响；将QBC₉₃₉细胞接种于裸鼠皮下，建立胆管癌裸鼠种植模型，观察体内种植瘤的发生率及Ad-P27mt对肿瘤生长的影响；经MTT比色法及流式细胞术检测5-氟尿嘧啶（5-FU）、丝裂霉素（MMC）、环磷酰胺（CTX）对转染P27^kip1前后的QBC₉₃₉细胞生长抑制及凋亡的影响。结果1．Ad-P27mt能诱导G0/G1期阻滞和细胞凋亡，从而在体内和体外显著抑制胆管癌细胞的生长；2．Ad-P27mt转染胆管癌细胞QBC₉₃₉后，5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和环磷酰胺对QBC₉₃₉细胞生长抑制率，分别由41.89％、45.59％和38.91％显著增加为56.15％、55.65％和51.69％；凋亡率也由16.76％、13.63％和10.46％，明显升高为44.39％、37.46％、36.94％，差异均有显著性意义（P＜0.05）。结论1．携带人突变P27^kip1基因的重组腺病毒对QBC₉₃₉细胞的增殖有明显的抑制作用，并诱导强烈的G1期阻滞和细胞凋亡，是胆管癌基因治疗的新途径。2．P27^kip1在QBC₉₃₉细胞中高表达，能显著增强胆管癌细胞对化疗药物的敏感性，为基因联合化疗药物治疗胆管癌提供了参考依据。