人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子超家族新成员,它与某些免疫疾病的制病机制密切相关,其低量或过量表达均能引起机体的免疫失衡。本研究以大肠杆菌BL21(λDE3)表达重组hBLyS的可溶性蛋白为抗原,分别免疫日本大耳白兔和BALB/c小鼠,制备出抗hBLyS的多克隆和单克隆抗体,并对这两种抗体的一些特性进行鉴定。此外,应用这两种抗体建立hBLyS的双抗夹心ELISA检测方法。 1 抗hBLyS多克隆抗体的制备与鉴定 选取2～3kg的雄性日本大耳白兔,淋巴结注射弗氏佐剂乳化的可溶性hBLyS蛋白,每间隔2周注射一次;第3次免疫后11天,耳动脉采血,间接ELISA检测抗血清的效价为50万倍;颈总动脉放血,制备抗血清,并应用分级饱和硫酸铵盐析法进行纯化,westen-blot分析抗体的特异性。 2 抗hBLyS单克隆抗体的制备与特性鉴定 用hBLyS蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,通过5次亚克隆获得1株分泌抗hBLyS单克隆抗体的杂交瘤细胞,,染色体数目在87～101之间:该抗体属于IgG1类蛋白,其腹水效价可达2×10~6通过western-blot鉴定其特异性良好。采用小鼠腹腔注射法大量制备抗体,A蛋白亲和层析法纯化抗体。 3 建立检测hBLyS蛋白含量的ELISA方法 选用2种ELISA方案对hBLyS蛋白含量的测定方法进行研究,方案一用链霉亲和素做间接包被,方案二用生物素-亲和素系统做终反应放大;优化选择2种检测方法的反应条件;方法一的敏感度较低:方法二在hBLyS蛋白浓度为3.2～400 ng/mL范围内,标准曲线的线性关系良好;从而建立了一种可检测hBLyS蛋白浓度为ng级水平的ELISA方法。