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微阵列芯片技术可以大幅降低免疫检测的样品用量和试剂用量,并且可以同时提高检测的并行化和多重化水平,因而成为近年来免疫检测技术研究的热点。微米球是常见的生物分子固相载体,其表面可被多种活性基团修饰,便于以多种方式固定生物大分子,因此被广泛应用于DNA分子杂交、测序和蛋白质相互作用等领域的研究中。本文的目标是制备基于微米球的微米坑阵列的ELISA芯片。首先,设计DNA发卡结构,再选择用于固定DNA和蛋白质的交联剂,并将DNA和蛋白质同时固定到微米球表面,最后制备微米坑阵列ELISA芯片。本研究根据这个主题主要开展了几个方面的工作。设计氨基标记的单链DNA的序列使其能在复性后形成发卡结构DNA,通过20%非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测验证该序列单链DNA在复性后可以形成实验预期的发卡结构DNA。为了确定DNA和抗体在微米球上的固定效果,对两种常用交联剂戊二醛和碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(EDC/sulfo-NHS)的交联效果做了比较。将表面修饰氨基和羧基的两组直径为4μm的微米球,分别用戊二醛和EDC/sulfo-NHS活化,进一步交联等摩尔浓度的发卡DNA和人TNF-?捕获抗体,结果表明戊二醛的固定效果优于EDC/sulfo-NHS。从而选择戊二醛为交联剂将Cy3标记的发卡DNA和藻红蛋白(R-PE)分别固定到微米球表面并进行荧光观察,再通过调整DNA和蛋白质的比例将FAM标记的发卡DNA和R-PE同时固定到微米球上并观察荧光,为实现用DNA序列编码的微米球上多种生物标志物ELISA检测奠定了基础。在本实验室前期微米坑-微米球阵列工作基础上,制备了基于微米球的DNA微阵列和蛋白质微阵列。用戊二醛将人CD40捕获抗体固定到微米球表面,再依次结合人CD40抗原、生物素标记的人CD40检测抗体和链霉亲和素标记的R-PE(SA-RPE)或链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶(SA-SβG),在微米球表面形成免疫复合体。将免疫复合体装载到微米坑阵列中获得荧光免疫芯片或ELISA芯片,并在封闭的微米坑芯片上进行ELISA反应,验证硅基微米坑芯片上ELISA的检测潜力,为实现高度多重化、高度并行化和低检测限检测奠定基础。此外,为了将来检测自动化,还设计制备了与微米坑芯片相匹配的微流控系统。