论文部分内容阅读
目的:探讨槐耳(Huaier)是否可以逆转人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)细胞株CEM-C1细胞对糖皮质激素(glucocorticoid,GC)的耐药性及其可能机制。方法:1.细胞培养:通过体外细胞培养技术培养人急性T-ALL细胞白血病细胞系CEM-C1和CEM-C7细胞。2.实验分组:(1)根据槐耳的干预浓度(50、100、200、400、600、800μg/ml)将CEM-C1、CEM-C7细胞分别分为6组;(2)根据地塞米松(dexamethasone,DEX)的干预浓度(12.5、25、50、100、200μg/ml)将CEM-C1、CEM-C7细胞分别分为6组;以及DEX不同浓度(12.5、25、50、100、200μg/ml)联合槐耳(100μg/ml)将CEM-C1、CEM-C7细胞分别分为6组;(3)根据耐药细胞系CEM-C1与敏感细胞系CEM-C7是否经槐耳优化浓度(0、200、600μg/ml)处理分别分为3组;(4)CEM-C1细胞根据是否加入PIM3的抑制剂AZD1208(5μM)分为对照组(Control)、抑制剂组(AZD1208)、槐耳组(Huaier)、槐耳联合抑制剂组(Huaier+AZD1208)。3.细胞增殖与毒性检测法(Cell counting kit-8,CCK-8):(1)检测经由不同浓度的槐耳处理24h、48h、72h后CEM-C1、CEM-C7两种细胞的增殖情况的变化;(2)检测经由不同浓度的DEX处理及联合槐耳作用后各组细胞的增殖情况的变化;(3)确定槐耳对CEM-C1、CEM-C7两种细胞的IC50及CEM-C1细胞对DEX的敏感性的变化;同时明确槐耳的最佳干预浓度及干预时间。4.细胞凋亡的检测:(1)通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测不同浓度的槐耳干预48h后CEM-C1、CEM-C7两种ALL细胞系的细胞凋亡情况;(2)通过Hoechst 33258染色检测不同浓度的槐耳干预48h后两种ALL细胞系的细胞凋亡情况。5.细胞周期的检测:通过FCM检测不同浓度的槐耳干预48h后CEM-C1和CEM-C7细胞周期改变情况。6.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR):检测CEM-C1和CEM-C7两种细胞中以及不同浓度(0、200、600μg/ml)槐耳干预CEM-C1细胞后PIM3-mRNA的表达情况。7.蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB):(1)检测CEM-C1和CEM-C7细胞中PIM3、MDR1蛋白表达情况;(2)检测不同浓度(0、200、600μg/ml)槐耳干预CEM-C1细胞后PIM3、MDR1蛋白表达情况;(3)检测在PIM3抑制剂AZD1208(5μM)处理CEM-C1细胞后各组细胞PIM3、MDR1蛋白表达情况。结果:1.槐耳抑制ALL细胞增殖:(1)槐耳呈剂量依赖方式抑制CEM-C1、CEM-C7细胞增殖,且在48h作用最明显;(2)槐耳对CEM-C1、CEM-C7细胞的IC50分别是313.4μg/ml和757.5μg/ml。2.槐耳对CEM-C1细胞的耐药逆转作用:(1)不同浓度的DEX单药作用CEM-C1细胞48h后的IC50为98.89μg/ml,而作用CEM-C7细胞的IC50为0.16μg/ml,耐药倍数为618.06倍;(2)DEX+槐耳对CEM-C1细胞的IC50为73.75μg/ml,耐药逆转倍数为1.34倍,而对CEM-C7细胞IC50值并无明显影响;(3)与单用DEX相比,槐耳+DEX对CEM-C1细胞的抑制率明显增加,且两药相互作用指数(Coefficientof drug interaction,CDI)均<1。3.槐耳促进ALL细胞的凋亡:(1)FCM检测发现随着槐耳药物浓度的增加,凋亡率显著增加(P<0.05);(2)Hoechst 33258检测到槐耳以剂量依赖性方式促进ALL细胞凋亡。4.槐耳对CEM-C1和CEM-C7两种细胞系的细胞周期阻滞不明显(P>0.05)。5.槐耳下调CEM-C1细胞中MDR1蛋白的表达:(1)与CEM-C7相比,CEM-C1细胞中MDR1蛋白表达显著增加(P<0.05);(2)随着槐耳浓度增加,CEM-C1细胞中MDR1蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。6.槐耳下调CEM-C1细胞中PIM3-mRNA及蛋白表达:(1)与CEM-C7细胞相比,CEM-C1细胞中PIM3-mRNA及其蛋白表达显著增加(P<0.05);(2)随着槐耳浓度增加,CEM-C1细胞中,PIM3-mRNA及其蛋白表达降低(P<0.05);(3)在CEM-C1细胞中,加入了PIM特异性抑制剂AZD1208后,与对照组(Control)相比,PIM3抑制剂(AZD1208)组、Huaier组与Huaier+AZD1208组中PIM3与MDR1的蛋白表达均呈明显下调趋势(P<0.05),且AZD1208+Huaier组表达最低。结论:1.槐耳能抑制CEM-C1、CEM-C7细胞的增殖,促进其凋亡;2.槐耳在一定程度上逆转CEM-C1细胞对GC的耐药性,其机制可能与PIM3下调有关。