目的本研究主要基于中医藏象学说心脑相关理论,从最高级中枢大脑皮层水平首先探讨失眠的阳盛阴衰、阴阳失交与大脑皮层兴奋抑制失衡之间的关系,主要观察大鼠经对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射进行失眠造模的不同时间点线粒体的变化和失眠造模对不同月龄大鼠皮层线粒体的影响；其次在上一阶段实验的基础上,从线粒体途径探讨安寐汤治疗失眠的机制,为进一步研究中医药改善失眠的作用机制和临床治疗提供理论参考。方法第一部分：首先采用3月龄SPF级SD大鼠,雌雄不分,3-21月龄,按文献对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射的方法进行失眠模型制作,并分别于造模后第1、2、3和4天观察额叶皮质神经元线粒体形态功能的改变；采用超活染色和电镜分别观察线粒体的数目和超微结构变化,同时采用荧光显微镜检测线粒体膜电位改变和WST-1法测定线粒体ATP酶含量。其次,基于上述最佳变化时间点采用3、6、9、12月龄大鼠进行造模3天后分别观察线粒体的数目和超微结构变化,同时采用荧光显微镜检测线粒体膜电位改变和WST-1法测定线粒体ATP酶含量。第二部分：基于第一部分最佳时间点和最佳月龄,采用PCPA法对9月龄大鼠进行造模,随机分为正常对照组、模型组、安定治疗组、褪黑素治疗组和安寐汤低、中、高剂量治疗组；采用超活染色和电镜分别观察线粒体的数目和超微结构变化,同时采用荧光显微镜检测线粒体膜电位改变和WST-1法测定线粒体ATP酶含量,以及黄嗓吟氧化法、硫代巴比妥酸法检测皮层线粒体SOD和MDA的变化。两部分方法具体如下：1.模型制作失眠模型制作采用对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射的方法。除正常组注射生理盐水外,其余组按0.3ml/100g腹腔注射PCPA(?)昆悬液(浓度为0.1g/m1)。2.线粒体制备实验结束后各组大鼠经10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,迅速断头取脑并立即置入冰冷的生理盐水中,洗净血污,剥离皮层并于2m1的分离介质中剪碎,迅速转移至玻璃匀浆管中(1min之内完成),电动匀浆,分离介质稀释,离心,所得沉淀用分离介质悬浮,制成lml混悬液。装在离心管中于碎冰中保存。全程冰上操作,提取完成后立即测定。线粒体蛋白含量以考马斯亮兰(Bradford)法进行测定。3.线粒体超活染色观察实验结束后用脊椎脱臼法处死大鼠,在枕骨大孔处迅速剪断延髓,去颅骨,完全暴露脑组织,取出脑组织,分离出额叶皮质后,在冰冷生理盐水中洗净后,在冰浴条件下充分匀浆,离心,取上清液待用。詹纳斯绿B (JGB)可特异性地使具有活性功能的线粒体呈现蓝绿色,从而判断线粒体功能的完整性。具体按照线粒体功能詹纳斯绿B (JGB)染色试剂盒说明书操作。4.线粒体的超微结构观察动物实验结束后,1%戊巴比妥钠(0.2ml／l0g)腹腔注射麻醉动物,灌注后取脑,留取大脑额叶皮质直径3mm的组织块,放入混合固定液中固定。修1mm×1mm×1mm大小组织块,2.5%戊二醛和1%四氧化锇酸双重固定,漂洗,丙酮逐级脱水,Epon812包埋,半薄切片光学定位,超薄切片厚度为50nm,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色后于透射电镜下观察。每只大鼠观察1张铜网,每张铜网由左上角至右下角斜线上下移动,随机拍摄5张照片,底片放大1.5万倍。5.线粒体Na+-K+-ATP, Ca2+-Mg2+-ATPase测定各组大鼠实验结束后断头处死,迅速在冰盘上取大鼠脑部皮质,暂时保存待测。用滤纸吸干大脑皮质外部残血,精确称重,加入冰生理盐水,制备成组织匀浆。取组织匀浆用普通离心机离心,弃沉淀取上清,再低温离心,沉淀物为线粒体(线粒体的提取按试剂盒要求操作,中性红-詹纳斯绿B染色鉴定线粒体),线粒体中Na+-K+-ATP, Ca2+-Mg2+-ATP酶严格按照南京建成生物的试剂盒操作步骤进行测定。6.线粒体膜电位测定取出新鲜切除的大鼠额叶皮质样本0.5cm并压平,加入37℃预热的清理液2ml清洗皮质组织并小心抽去清理液,再用900u1染色工作液浸没整个组织,放进37℃培养箱孵育20min,抽去染色液,再用清理液一遍后开始切片约100um厚,然后置于载玻片上,盖上盖玻片,用手指轻轻压平,即刻在荧光显微镜下观察并拍照。结果第一部分：1.动物失眠模型的建立模型组大鼠在注射后的第一天昼夜节律正常,未见躁动不安；连续注射2d后,大鼠白天活动增多,对外界声、光刺激敏感;造模后第三天出现昼夜节律消失,白天夜晚活动不停；连续注射4d后,大鼠躁动不安非常明显。2.线粒体超活染色观察高倍光镜下可见3月龄各组线粒体形态有的呈短棒状,有的呈线状和近椭圆状,并且部分有聚集现象,其中造模各组的染色线粒体数目较正常对照组明显减少,尤其是以造模后第3天和第4天减少最为明显。而不同月龄大鼠造模3天后,和各正常对照组相比,以9月龄模型组的额叶皮质神经元线粒体的数目减少最为显著；而在各模型组中,又以12月龄大鼠模型组的线粒体最少。3.线粒体超微结构观察3月龄大鼠造模后第一天额叶皮层线粒体有轻微的肿胀,嵴有少许的断裂；造模后第二天线粒体肿胀开始明显,嵴断裂较多且出现边集化；造模后第三天线粒体进一步肿胀,嵴大部分断裂且开始出现空泡化；造模后第四天线粒体空泡化进一步加重。3、6月龄正常大鼠的额叶皮质神经元线粒体的体积不大,而9月龄的则明显变大；12月龄的线粒体体积不仅变大,同时内部的嵴也现了少许的断裂,说明12月龄大鼠脑内的线粒体出现凋亡,提示线粒体的功能出现下降。各正常对照组的线粒体体积不大,单位面积内嵴的数量也比较多,而相应的各模型组的线粒体体积较大,单位面积内嵴多有断裂,数量较少,有的甚至出现空泡化。其中,9月龄正常组大鼠线粒体略有肿胀,相应的模型组大鼠线粒体肿胀非常明显,嵴基本断裂,空泡化较为严重。而12月龄正常组大鼠线粒体不仅略有肿胀,而且嵴开始有部分断裂,相应的模型组大鼠线粒体肿胀也非常明显,嵴几乎全部断裂边集化且明显空泡化。4.线粒体膜电位测定模型组大鼠的膜电位与3月龄正常大鼠相比都下降,可见红色荧光逐渐减少,其中以造模后第4天下降最明显。3月龄正常大鼠造模开始后,绿色荧光也开始增加,并呈现由低到高再到低的趋势；说明造模后第4天大鼠额叶皮质神经元线粒体出现量的变化。9月龄正常大鼠的额叶皮质红色荧光最强,说明线粒体膜电位正常且线粒体功能最为旺盛；而12月龄正常大鼠随着月龄的增长,红色荧光减少且出现了棕黄色荧光,提示线粒体的膜电位出现了下降,线粒体功能开始减弱。与9月龄正常大鼠相比,各模型组大鼠额叶皮质红色荧光明显减弱,而绿色荧光逐渐增强。随着月龄增大,黄绿色荧光开始变成深绿色,说明部分线粒体的膜电位开始下降。5.线粒体Na+-K+-ATP, Ca2+-Mg2+-ATPase测定对于3月龄大鼠,经PCPA腹腔注射造模,随着天数的增加,造模的各模型组Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性逐渐下降,与正常对照组相比均具有统计学意义(p<0.05)；其中造模后第三天和第四天下降尤为明显,且两组之间无统计学意义。同时,随着月龄的增加,正常大鼠大脑额叶皮质线粒体的Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶有先升后降的趋势。6月龄正常大鼠的酶活性最强,12月龄正常大鼠的酶活性最低,而9月龄和3月龄正常大鼠的酶活性相比较则无统计学意义。各模型组与正常对照组相比都具有统计学意义；但9月龄和12月龄大鼠造模后酶活性却不具有统计学意义,说明造模选择9月龄的大鼠为佳。第二部分：1.线粒体超活染色观察高倍光镜下可见造模后大鼠额叶皮质线粒体数量较正常大鼠明显减少,安定和褪黑素给药后线粒体的数量又显著增加；而低剂量安寐汤两个疗程灌胃后线粒体有所增加,中剂量安寐汤灌胃后较为明显,高剂量安寐汤灌胃后线粒体数目增加明显。2.线粒体超微结构观察9月龄正常大鼠造模后额叶皮层线粒体明显肿胀,嵴大部分断裂且出现边集化甚至空泡化,说明线粒体功能下降明显；经安定和褪黑素治疗后线粒体肿胀明显减轻,线粒体比较完整；而安寐汤低剂量治疗后线粒体肿胀有所减轻,但体积仍较正常组增大,线粒体嵴仍有部分断裂,线粒体不完整；中剂量和高剂量安寐汤灌胃治疗后线粒体较为完整,体积不大,嵴几乎无断裂。3.线粒体膜电位测定模型组大鼠的膜电位与9月龄正常大鼠相比明显下降,可见红色荧光明显减少,而绿色荧光明显增加,提示线粒体膜电位下降。安定和褪黑素治疗组也见红色荧光较模型组明显增加；而低剂量和中、高剂量安寐汤治疗组红色荧光则逐渐增多,说明线粒体膜电位逐渐好转。4.线粒体Na+-K+-ATP,Ca2+-Mg2+-ATPase测定各组与模型组相比大鼠额叶皮质神经元线粒体Na+-K+-ATPase都具有统计学意义(p<0.01),说明造模后各种药物治疗是有效果的；但与正常对照组相比只有模型组和安寐汤低、中剂量治疗组具有统计学意义(p<0.05),这提示尽管安寐汤低、中剂量有疗效但仍不足以恢复到正常水平,同时也说明安定、褪黑素和安寐汤高剂量的疗效和正常组大鼠接近而差不多；安定治疗组与安寐汤低剂量治疗组和模型组相比具有统计学意义(p<0.05),说明低剂量的安寐汤疗效不显著,同时尽管随着安寐汤剂量的增加Na+-K+-ATPase的含量也增加,但低中高三种剂量的疗效之间却无统计学意义。另一方面,无论是模型组还是各治疗组与正常对照组相比,大鼠额叶皮质神经元线粒体Ca2+-Mg2+-ATPase都有所下降,但都具有统计学意义(p<0.05)；同时各治疗组与模型组相比也都具有统计学意义(p<0.01)；安寐汤低、中剂量的疗效与安定和正常大鼠相比还是有统计学意义的(p<0.01),但低剂量与褪黑素、中与高剂量的疗效之间却无统计学意义,这说明尽管随着安寐汤剂量的增加Ca2+-Mg2+-ATPase的含量也增加,以及低与高剂量疗效之间有统计学意义(p<0.05),但中高三种剂量的疗效之间却无统计学意义。综上所述1、3月龄大鼠造模后线粒体数量明显减少,超微结构以第3天变化最为显著;额叶皮层线粒体膜电位和ATP酶活性第2天开始明显下降,第3天下降最明显(p<0.05),第4天略有回升。2、9月龄大鼠造模后线粒体超微结构空泡化、膜电位和酶活性与12月龄模型组均显著,且无统计学意义。3、安寐汤治疗后大鼠额叶皮质神经元线粒体数目明显增加,超微结构趋于好转,线粒体膜电位增加,同时随着安寐汤剂量的增加线粒体Na+-K+-ATPase、 Ca2+-Mg2+-ATPase的含量也增加,但不具有统计学意义。结论1、以3月龄大鼠进行PCPA制作失眠模型过程中额叶皮层线粒体超微结构和功能变化以连续注射3天最明显。2、PCPA对失眠大鼠模型制作以9月龄为佳且可通过影响额叶皮层线粒体的形态和功能来导致失眠发生。3、安寐汤可以增加失眠大鼠额叶皮质神经元线粒体的数目和改善线粒体的超微结构变性；安寐汤可改善额叶皮层神经元线粒体膜电位和增加Na+-K+-ATPase、 Ca2+-Mg2+-ATPase的含量,这可能是其改善失眠的作用机制之一；安寐汤可增加Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase的含量,但剂量依赖性不明显。4、失眠大鼠皮层线粒体的形态功能的减退与改善与皮层的兴奋抑制平衡失调和失眠的阳盛阴衰、阴阳失交可能存在密切的联系。创新点1、中医药治疗失眠的临床报道较多,基础研究也多是基于西医神经递质理论从低位脑干和丘脑等水平探讨,本研究首次从高位的最高级中枢大脑皮层水平来研究失眠的发病机理和安寐汤的改善作用。2、本研究基于中医藏象学说的心脑相关理论,在以往中医药失眠研究没有形态学和分子水平上的证实的前提下,从线粒体角度来探讨失眠阳盛阴衰、阴阳失交与皮层兴奋与抑制失衡之间的联系以及安寐汤改善失眠的机理。存在问题1、限于大鼠饲养周期和经费问题,本研究没能在大鼠的年龄跨度上开展多个月龄的实验,也没能在造模后更多的时间点上开展探讨；2、本研究未能从分子生物学的角度在基因、mRNA和蛋白表达等不同的水平展开进一步的检测,后期可做连续深入的探索,也可为失眠的大脑皮层角度的基础外围研究提供参考。