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目的：β地中海贫血是β-珠蛋白基因调控区域或编码序列的缺失或突变导致p-珠蛋白链合成障碍,而引起的慢性溶血性疾病。该病为世界上发病率最高的单基因遗传病之一,目前尚无疗效满意的治疗方法。β地中海贫血的基因治疗策略为通过载体介导正常β-珠蛋白基因转移入地贫患者造血干细胞内,增加红系细胞中正常β-珠蛋白链合成,重建α链与β链之间的平衡,达到长期缓解或治愈β地贫的目的。本室早期实验已证实AAV载体能介导人β-珠蛋白基因长期稳定表达于地贫小鼠和正常人的造血细胞中。在此基础上,本课题拟通过ex vivo途径,以AAV病毒转染来源于重型β地贫流产胎儿的造血细胞,检测其介导的β珠蛋白基因的体内表达,进一步探讨AAV载体应用于β地中海贫血基因治疗的可行性。方法与结果：1.获取携带人β-珠蛋白基因的重组腺相关病毒载体酶切鉴定克隆有miniLCR和β-globin结构基因的pMT-2质粒,然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pMT-2, pAAV-RC, pHelper共转染HEK293细胞,包装含有人β-珠蛋白基因的rAAV2-β-globin病毒；通过肝素亲和层析法纯化制备重组AAV2载体；斑点杂交法(dot-blot)和SDS-PAGE蛋白电泳检测表明获得高纯度的滴度为1010vg/ml级别的rAAV2-β-globin病毒。2.携带人β-珠蛋白基因的rAAV2载体在MEL中的表达以rAAV2病毒体外转染MEL细胞,PCR、RT-PCR结果显示MEL细胞本身并不存在人β-珠蛋白基因,AAV载体可介导外源性人p-珠蛋白基因转移入MEL细胞中并获得表达。说明rAAV2病毒载体在体外可有效转染红系细胞并介导珠蛋白转基因在其中的表达。3.rAAV2介导人β-珠蛋白基因转导纯合子型重型β地中海贫血胎儿造血细胞在体外实验的基础上,我们分离了1例诊断明确的β41-42纯合子型重型β地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=10)后移植入经环磷酰胺预处理的4只BALB/c裸小鼠体内。等位基因特异性PCR结果表明,移植后14d受体鼠体内除检测到突变的β41-42基因表达外,同时可检测到AAV载体介导的正常人β-珠蛋白基因表达,且该表达至少可持续至移植后27d。提示AAV可有效转染纯合子型地中海贫血患者的造血细胞,并通过ex vivo途径介导β-珠蛋白转基因在小鼠体内的表达。4.rAAV2介导人β-珠蛋白基因转导杂合子型重型β地中海贫血胎儿造血细胞为进一步研究AAV载体对于临床上更为常见和复杂的杂合子型地贫患者的转染效率,在纯合子型流产地贫胎儿实验基础上,我们继续分离了5例杂合子型p地贫流产胎儿造血细胞,其基因型依次为：β41-42/β71-72型,β654/缺失型,β41-42/β654型,β41-42/βE型及β41～42/β645型。胎儿造血细胞经rAAV病毒转染(M0I=10或50)后输入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,于移植后不同时间点处死小鼠,检测体内人β-珠蛋白基因的表达。结果发现,小鼠骨髓及外周血中均能检测到人p-actin基因表达,提示胎儿造血细胞的成功植入。等位基因特异性PCR分析发现,在10MOI转染的β654/缺失型胎儿样本中,由于有限的转基因表达水平以及β654突变基因所表达的正常β-珠蛋白基因的干扰,无法准确检测出AAV载体介导的正常β-珠蛋白基因表达,但在其余4例样本中,均明确检测到AAV介导的外源性β-珠蛋白基因表达,且该表达至少可持续至移植后70d。此外,我们用高灵敏度的HPLC方法检测了β-珠蛋白基因在小鼠外周血人红系细胞中的表达,结果显示AAV载体在10MOI与50MOI两个感染复数下均可增加红系细胞中人β-珠蛋白肽链的合成,且50MOI转染组的转染效率和转基因表达稳定性均明显高于10MOI组。结论：本研究表明AAV病毒载体可有效转染来源于重型β地中海贫血流产胎儿的造血细胞,经AAV转染后的造血细胞在BALB/c裸小鼠体内可获得正常人β-珠蛋白转基因的长期、稳定表达,以及外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。