Lyp(Lymphoid-specifictyrosinephosphatase)是由PTPN22编码的非受体型酪氨酸磷酸酶，主要在免疫系统中表达。Lyp由807个氨基酸构成，包括N端300个氨基酸的催化结构域和C端500个氨基酸左右的调节区域构成。当前的研究认为，Lyp可以通过去磷酸化Lck、Fyn、ZAP70等蛋白来负调控T细胞的信号转导。Lyp的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)C1858T使PTPN22在620位的酪氨酸替换为精氨酸（即R620W突变），携带R620W突变的人群更容易患自身免疫性疾病，包括Ⅰ型糖尿病(TypeⅠDiabetes，T1D)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)、风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、幼年特发性关节炎(juvenileidiopathicarthritis，JIA)和Gravesdisease等。虽然R620W一直被认为是功能增进型的突变，但是最近研究显示R620W导致自身免疫病可能由于它在T细胞信号转导过程中的功能缺失。同时有研究表明Lyp催化区域的基因多态性R263Q可以降低SLE、RA和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)的患病率，但增加肺结(pulmonarytuberculosis，PT)的易感性。遗传学研究还发现在人类中存在其他Lyp的基因多态性，包括S201F，R266W等，其中S201F和R266W不增加Ⅰ型糖尿病的患病风险。为进一步分析这些基因多态性对Lyp生化性质和功能的影响，我们检测了Lyp基因多态性S201F、R263Q和R266W对小分子底物，磷酸多肽底物和蛋白底物的磷酸酶活力;以及这些突变导致Lyp在T细胞信号转导途径和免疫应答中功能的变化。本实验结果说明Lyp的S201F突变虽然改变了Lyp对小分子底物的催化活力，但其对磷酸多肽底物和蛋白底物的活力影响甚小，并对Lyp在T细胞中的功能产生较小的影响。Lyp的R263Q和R266W突变显著减低了其对磷酸多肽底物的活力，并减弱了Lyp对T细胞免疫应答的抑制作用。这些结果预示除R263Q可减低一些自身免疫性疾病的风险外，R266W基因多态性也可能通过影响Lyp的功能而对自身免疫性疾病易感性产生影响。　　 [研究目的]　　 研究淋巴组织特异酪氨酸磷酸酶(Lyp)的不同突变（S201F、R263Q和R266W的生化特性和细胞功能。　　 [研究方法]　　 1.生化特性　　 (1)用PrimerX软件设计引物，以PET-16b-Lyp-CD-His-wildtype为模板用QuikChange的方法构建不同突变的Lyp的质粒:S201F，R263Q，R266W。　　 (2)在BL21大肠杆菌中过表达Lyp催化区域的蛋白(wildtype，S201F,R263Q，R266W)，通过Ni2+-NTA柱和CM阳离子交换柱纯化，以获得可以进行生化分析的高纯度蛋白。　　 (3)用纯化的蛋白进行酶动力学研究:　　 1)检测Lyp不同突变对小分子底物pNPP磷酸酶活力。　　 2)检测Lyp不同突变对含有磷酸化酪氨酸的9个氨基酸短肽pLck394的磷酸酶活力。　　 3)体外纯化Src蛋白，用westernblotting检测Lyp不同突变对其416位点的磷酸酶活力。　　 4)比较Lypwildtype和R266W在pH值4-8.7时对pNPP的磷酸酶活力。　　 2.细胞功能　　 用电转的方法将质粒(pcDNA4-Lyp-CD-mycHis-wildtype，F201，Q263W266)转染JurkatT细胞，培养细胞48小时后用培养基（对照）和anti-CD3刺激，用特异性的抗体检测野生型和各突变对ERK和Lck394磷酸化水平的影响，比较Lyp不同突变T细胞信号转导途径中磷酸化水平的影响。　　 [研究结果]　　 1.生化特性　　 (1)质粒构建成功。　　 (2)通过Ni2+-NTA柱和CM阳离子交换柱，Lypwildtype，S201F，R263Q和R266W的蛋白纯度都可以达到95％以上。　　 (3)酶动力学研究:　　 1)对小分子底物pNPP的磷酸酶活力:Kcat/Km值可以反映磷酸酶活力的大小，Q263的Kcat/Km值与WT相比，差别没有统计学意义(P＞0.05)。Lyp的S201F，R266W的Kcat/Km值与野生型相比，分别降低了50％和80％。　　 2)对含有磷酸化酪氨酸的9个氨基酸短肽pLck394磷酸酶活力:F201，Q263，W266的Kcat/Km值与野生型相比，分别降低了20％，40％和60％。　　 3)对体外纯化Src蛋白的磷酸酶活力:反应5分钟，Lyp野生型可以使Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低50％。Lyp的F201和Q263分别需要10分钟和30分钟使Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低50％。而W266的活力显著降低，反应30分钟才能Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低20％。　　 4)在不同的pH值下测Lyp野生型和W266对小分子底物pNPP的酶活变化，计算出酶限速反应阶段的解离常数pKb(wildtypeR266=6.54，W266=6.01)。　　 2.细胞功能　　 野生型Lyp和三个突变能不同程度的影响T细胞内Lck和ERK的水平。抑制T细胞的能力:wildtype＞F201＞Q263＞W266。　　 [结论]　　 F201降低了Lyp磷酸酶活力，但对Lyp在T细胞信号转导中的作用基本无影响，而Q263、W266相比野生型的磷酸酶活力明显减弱，明显减弱了其对T淋巴细胞的免疫响应的抑制作用，因此称之为功能缺陷型突变。Q263由于功能缺失可以降低自身免疫性疾病的患病率，W266也可能降低某些自身免疫性疾病的患病率。抑制Lyp的磷酸酶活力可以作为治疗自身免疫性疾病的有效方法。