动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是由多种因素和作用环节介导的慢性进行性病理过程,其受多种遗传因素和外界因素的影响,是目前威胁人类生命的主要疾病之一,是导致冠心病、心肌梗塞等心血管病的主要病理生理基础。炎症和血脂异常是AS发生的主要动因。炎症反应过程贯穿于AS发生发展的各个阶段,在内皮细胞损伤、炎症细胞浸润、泡沫细胞形成、平滑肌细胞迁移增殖到脂质条纹、纤维斑块乃至复合病变形成的过程中都有炎症因素参与,AS是慢性局部炎症的观点已被广泛认可。目前对AS的早期发病机制还不明确,往往是血脂代谢紊乱、炎症以及糖代谢失衡等多种危险因素并存,共同影响着AS的发生发展。TNF-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）是生物体内主要的促炎因子和免疫调节因子,参与机体的急、慢性炎症过程。在人类和小鼠的AS病变部位均可检测到TNF-α的存在。TNF-α促进血管内皮细胞粘附分子表达,刺激血管内皮细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞的活化与迁移,通过诱导其分泌细胞因子等方式,发动炎症反应。但关于TNF-α在AS中,尤其是脂质条纹期的具体作用尚未被完全认识。作为一种免疫调节因子,TNF-α在AS发生过程中对其它炎症因子和细胞因子的表达具有什么影响?它在AS不同阶段中的作用是否一致?除炎症反应外,TNF-α是否还存在其它途径参与AS发生发展过程?ApoE基因缺失(apoE deficient, apoE^-/-)小鼠在普通标准饮食条件下能够自发产生AS病变,且发病过程与人类AS极为相似,是研究人类AS的理想模型,为研究人类AS的发病机理以及干预治疗提供了极大的方便。本实验利用apoE^-/-/TNF-α-/-（AT）双基因突变小鼠和apoE基因缺失(apoliprotein E deficient, apoE^-/-)小鼠为实验材料,利用血生化分析、Real-time RT-PCR、细胞因子抗体芯片等检测技术,结合冷冻切片、常规病理染色等形态学分析方法,对不同年龄条件下AT和apoE^-/-小鼠的血脂水平、主动脉AS病变进行了观察测定,同时对小鼠脾脏和主动脉中炎症相关基因,肝脏中胆固醇逆转运相关基因的转录水平进行了分析,并测定了6周龄小鼠主动脉中64种细胞因子的含量,旨在明确AS发生早期,TNF-α对apoE^-/-小鼠炎症因子等细胞因子表达的影响作用,同时进一步确定TNF-α在AS过程中可能的作用途径与作用特点。实验主要结果如下:1.小鼠主动脉根部病理形态观察和病变面积分析:病理形态观察结果表明,apoE^-/-小鼠主动脉根部内膜自4周龄起开始出现轻度的内膜脂质沉积,苏丹IV染色阳性区面积和斑块厚度随年龄增长逐渐加重。大部分AT小鼠4周龄时,主动脉根部镜检时未发现明显脂质沉积,至6周龄开始出现脂质沉积,但病变面积和病变程度要轻于同年龄段的apoE^-/-小鼠。至8周龄时,apoE^-/-和AT小鼠小鼠主动脉内膜处均出现显著脂质沉积,并伴有泡沫细胞聚集。随小鼠年龄增大,主动脉根部斑块分布区域增多,平均面积进一步增大。16周龄小鼠主动脉壁一侧部分区域苏丹IV着色不均,表明平滑肌细胞发生表型转换,迁移进入病灶部位并吞噬脂质形成平滑肌来源的泡沫细胞。至24周龄时,平滑肌细胞增殖迁移、吞噬脂质程度和病变面积进一步加重,管腔变小,血管壁变薄。病变面积分析结果表明,TNF-α促AS的作用在AS发生早期的作用更为显著。4周龄时,apoE^-/-小鼠主动脉瓣膜处平均病变面积是AT小鼠的7.81倍,6周龄时,是AT小鼠的2.58倍。随着小鼠年龄增加,TNF-α的作用有所减弱,至24周龄时,apoE^-/-小鼠主动脉根部的病变面积只比AT小鼠增加了29%。2.小鼠血脂生化指标检测:与野生型（wild type, WT）小鼠相比,apoE^-/-小鼠在各个年龄阶段均表现较为明显的脂质水平的升高。除4周龄和6周龄甘油三酯（triglyceride, TG）外,其余检测指标与WT相比均有显著性差异（P<0.05）。各年龄段TNF-α-/-小鼠的各项血脂水平与WT相比均不具有显著性差异。与apoE^-/-小鼠相比,AT小鼠的血脂水平呈现如下变化:AT小鼠各年龄段总胆固醇（total cholesterol, TC）水平均低于同年龄的apoE^-/-小鼠;AT小鼠各年龄段TG水平也均低于apoE^-/-小鼠,但自16周起才具有统计学意义（P<0.05）;apoE^-/-小鼠和AT小鼠的血浆低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）水平在各年龄段均未表现出显著性差异;4-12周龄时,血浆高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）水平apoE^-/-小鼠要高于AT小鼠,但16周龄时,AT小鼠血浆HDL-C水平已较apoE^-/-小鼠有所提高。以上结果表明,TNF-α参与了apoE^-/-小鼠脂质代谢过程,当TNF-α基因缺失后,影响了apoE^-/-小鼠的脂质代谢,而且这种影响可能是通过HDL的相关途径实现的。3.TNF-α缺失前后apoE^-/-小鼠脾脏中炎症基因转录变化特征:Real-time RT-PCR结果表明,TNF-α缺失之后,各个年龄段脾脏中炎症因子的表达均受到较大影响。与apoE^-/-小鼠相比,6周龄时,所检测的6种主要细胞因子的表达均有所下降,其中白细胞介素（interleukin , IL）10和IL-12 mRNA表达水平显著下调（P<0.05）,IL-1β和IL-4 mRNA表达水平下调极显著（P<0.01）。12周龄时,所检测的细胞因子在apoE^-/-小鼠和AT小鼠中的表达情况表达与6周时出现较大差异。与apoE^-/-小鼠相比,有4种细胞因子mRNA表达发生了显著变化:干扰素（interferon, IFN）γ和IL-1β出现了显著上调（P<0.05）,而IL-6和IL-10仍表现出显著下降的趋势（P<0.05）,而IL-4和IL-12mRNA表达水平发生轻微上调。24周龄时,所检测的各细胞因子的表达趋势与12周龄时相似,AT小鼠中IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-12的mRNA表达水平比apoE^-/-小鼠有所上升,而IL-6和IL-10的表达水平较apoE^-/-小鼠低,但是IL-1β、IL-4、IL-10和IL-12的差异不显著。这表明,TNF-α的缺失对于小鼠脾脏组织中炎症因子的表达具有影响作用,且这种影响作用呈现年龄依赖的特点。4.TNF-α缺失前后6周龄apoE^-/-小鼠主动脉炎症等细胞因子表达变化特征:（1）6周龄小鼠主动脉炎症基因转录变化特征:6周龄时,AT小鼠主动脉组织中IL-1β、IL-4、IL-6,IL-10、IL-12、IFN-γ的表达均较apoE^-/-小鼠有所下降,各基因表达趋势与脾脏组织基本一致,但只有IL-1β、IL-4、IL-12和IFN-γ的表达变化具有差异显著性（P<0.05）。AT小鼠主动脉中核转录因子（nuclear factor-κB, NF-κB）的转录水平显著低于apoE^-/-小鼠,而κB抑制因子（inhibitor-κB, I-κB）的表达量则较apoE^-/-小鼠有所上调。这些结果表明,TNF-α的缺失可能通过NF-κB信号途径影响了apoE^-/-小鼠主动脉组织中相关炎症因子基因转录水平。（2）6周龄小鼠主动脉细胞因子抗体芯片检测:抗体芯片检测结果表明,在所检测的64种细胞因子中,与apoE^-/-小鼠样品相比,AT小鼠主动脉样品共有20种细胞因子的表达差异超过2倍,其中2种发生上调[粘附相关激酶（adhesion-related kinase, ARK）和胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin-like growth factor banding protein,IGFBP）-6],18种发生下调[包括细胞分化簇抗原（cluster of differentiation, CD）30、CD30 L、CD40、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p40/p70、KC（keratinocyte-derived chemokine）、巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein, MIP）-1α、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-3α、血小板因子（platelet factor, PF）-4、胸腺活化调节趋化因子（thymus and activation-regulated chemokine, TARC）、胸腺表达趋化因子（thymus-expressed chemokine, TECK）、基质金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitory of metalloproteinase, TIMP-1）、可溶性TNF受体I（soluble TNF receptor, sTNFRI）和血小板生长因子（thrombopoietin, TPO）]。表达具显著性差异的主要是趋化因子家族成员（如KC、MIP、TARC、TECK等）、受体类分子（如Ax1、CD30L、CD40和sTNFRI等）、IL类成员（如IL-5、IL-6、IL-10和IL-12p40/p70等）,另外还包括少量的调节因子（如IGFBP-6和TIMP-1）。其余细胞因子的表达差异不显著。细胞因子抗体芯片结果表明,TNF-α缺失后影响了apoE^-/-小鼠主动脉中不同类型细胞因子的表达。这些细胞因子的下调减缓了单核细胞的活化和向内皮下的迁移过程,减轻了内皮细胞与单核/巨噬细胞以及T细胞的相互作用,从而减缓了AS病变进程。5.TNF-α缺失前后apoE^-/-小鼠肝脏中胆固醇逆转运相关基因表达变化特征:TNF-α可显著影响apoE^-/-小鼠肝脏组织中胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport, RCT）相关的基因表达,且这种影响在不同年龄阶段显现出不同的作用趋势。6周时,与apoE^-/-小鼠相比,所检测的六种基因的mRNA表达水平在AT小鼠中均发生下降,其中载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I, apo A-I）、肝X受体α（liver X receptor alpha, LXRα）、三磷酸腺苷结合盒A1（ATP binding cassette transporter A1, ABCA1）和β-羟基β-甲基戊二酰辅酶A还原酶（β-hydroxy-β-methyl glutaryl CoA reductase, HMG-CoAR）的表达显著下调。AT小鼠中apo A-I、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（lecithin-cholesterol acyltrasferase, LCAT）和B类清道夫受体I（scavenger receptor class B type I, SR-BI）的表达量自12周龄起表达量较apoE^-/-小鼠有所上调,至24周龄时、其表达量已较apoE^-/-小鼠显著上调（P<0.01）。LXRα和ABCA1表现出类似的表达特征。12周龄时,AT小鼠的表达量低于apoE^-/-小鼠,但至24周龄时,AT小鼠中的表达量也呈现出显著上调的趋势（P<0.01）。在检测的三个年龄段中,HMG-CoAR在AT小鼠中的表达量均较apoE^-/-小鼠低（P<0.05）。本实验结果说明,在apoE^-/-小鼠AS发生的不同阶段,TNF-α对胆固醇逆转运起到了不同的影响作用。6周龄时TNF-α可促进肝脏中RCT过程,而24周龄时,TNF-α又表现出较强的RCT的抑制作用,表现出其促AS活性。综上所述,TNF-α缺失可对apoE^-/-小鼠AS的发生起到一定的阻遏作用。在6周龄时,TNF-α缺失可通过下调脾脏及主动脉组织中IL-1β、IFN-γ和IL-12等I型细胞因子的转录活性,对apoE^-/-小鼠AS的进程起到抑制作用。细胞因子抗体芯片检测表明在6周龄小鼠主动脉中,AT小鼠中多种趋化因子、粘附分子MIP-1α、MIP-1β、KC、TARC、MCP-1、VCAM-1表达的下调表明,TNF-α通过影响这些成分的表达,促进了单核/巨噬细胞、T细胞、血管内皮细胞之间的相互作用,参与了泡沫细胞和脂质条纹病变的形成过程。但随着年龄增长,TNF-α对炎症因子在脾脏中的表达影响发生改变。12和24周龄时,IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-12的表达呈现出与6周龄相反的趋势,这提示TNF-α在apoE^-/-小鼠不同年龄阶段对炎症因子的表达具有不同的影响作用。血脂HDL-C检测结果提示,TNF-α可能通过RCT参与了apoE^-/-小鼠中脂质代谢过程。Real-time RT-PCR结果表明,小鼠肝脏中RCT相关基因的转录水平在TNF-α缺失前后发生显著变化。6周龄时,TNF-α缺失可以通过下调apo A-I、LCAT、SR-B1、LXRα和HMG-CoAR的表达抑制了RCT的进行,至24周龄时,又可以通过上调该基因的表达促进RCT。这表明TNF-α在apoE^-/-小鼠不同年龄阶段对RCT具有不同的影响作用。基于本实验研究结果,我们认为,TNF-α在apoE^-/-小鼠AS发生过程中表现出作用的复杂性和时间依赖性的特点。AS是多因素参与的复杂病变过程,TNF-α广泛参与了AS中炎症反应的调节和脂质代谢过程,并总体上表现出了促AS作用,其炎症和RCT调节表现出了不同的时间依赖性。我们推测,在AS早期病变脂质条纹时期,肝脏脂代谢紊乱可能只是一个重要始动因素,炎症在此过程中起到主导作用。