【背景】胃癌是全球四大恶性肿瘤之一,是导致肿瘤相关死亡的重要原因。由于缺乏有效地早期筛查手段,大部分胃癌患者就诊时,疾病已进入中晚期。对于晚期胃癌患者,化学治疗往往作为首要治疗方案。尽管目前已有多种化疗药物应用于临床,但是先天或获得性耐药尤其是多药耐药的出现最终导致化疗失败,甚至出现无药可医的局面。经过多年探索,研究者已发现多种多药耐药相关分子机制,然而有关胃癌多药耐药的确切机制至今尚未完全阐明。近期研究发现,micro RNA(mi RNA)可通过负性调控耐药相关基因的表达进而参与肿瘤细胞耐药。但截止目前,仅有少数几个mi RNAs被报道通过直接调节凋亡相关通路而参与胃癌细胞耐药。因此,有关mi RNA调控胃癌耐药的确切分子机制还有待进一步研究。本课题组前期研究中通过mi RNA表达谱芯片及高通量功能筛选发现一系列胃癌耐药相关的mi RNAs。经过数据分析,我们发现mi R-23b-3p可能在逆转胃癌细胞耐药的过程中发挥重要调节作用。因此,本研究拟在前期工作基础之上,深入探讨mi R-23b-3p在胃癌细胞耐药过程中的功能并阐明其可能的分子机制。最后通过组织芯片和原位杂交技术明确mi R-23b-3p表达水平与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。【目的】1.探讨mi R-23b-3p在胃癌多药耐药中的功能并阐明其相关分子机制。2.明确mi R-23b-3p与胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系。【方法】1.首先通过q RT-PCR检测mi R-23b-3p在胃癌耐药细胞模型中的表达情况。进一步通过功能获得、功能缺失及MTT实验检测mi R-23b-3p的表达变化对胃癌细胞耐药性和增殖的影响。2.采用生物信息学综合分析和筛选mi R-23b-3p下游潜在的靶基因。通过q RT-PCR,Western blot,Confocal laser scanning microscopy(CLSM,激光共聚焦显微镜)、细胞转染以及双荧光素酶报告基因等实验验证候选靶基因的表达及mi R-23b-3p对靶基因的调控作用。通过RNAi,q RT-PCR,Western blot及MTT实验检测靶基因在胃癌细胞的功能,同时明确两个靶基因之间是否存在调控关系。3.通过透射电镜(TEM)、Western blot,CLSM等观察胃癌多药耐药细胞与亲本细胞之间的自噬水平变化。4.通过RNAi,Western blot,自噬抑制剂CQ等检测靶基因对胃癌细胞自噬的调节作用以及自噬对胃癌细胞耐药性的影响。5.通过转染mi RNA inhibitor或mimics、CLSM,Western blot等实验检测mi R-23b-3p对自噬的调节作用。此外,通过q RT-PCR和Western blot实验检测化疗药物5-Fu处理另外两种胃腺癌细胞AGS和BGC823前后,细胞内mi R-23b-3p、靶基因及自噬表达水平的变化。进一步运用共转染的实验方法,明确mi R-23b-3p是否通过直接抑制靶基因介导的自噬进而参与调控胃癌细胞耐药。6.通过构建mi R-23b-3p慢病毒表达载体、建立稳定转染mi R-23b-3p或对照载体的胃癌耐药细胞系以及裸鼠皮下成瘤等实验,检测mi R-23b-3p能否在体内水平逆转胃癌多药耐药的作用。7.通过q RT-PCR、免疫组织化学、胃癌组织芯片以及原位杂交等技术检测mi R-23b-3p及其靶基因在胃癌组织标本的表达情况,进而分析mi R-23b-3p与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。8.通过生物信息数据库预测mi R-23b-3p转录起始位点上游Cp G岛分布情况,同时应用q RT-PCR检测去甲基化处理胃癌细胞前后,mi R-23b-3p的表达变化。【结果】1.过表达mi R-23b-3p显著增强胃癌耐药细胞对多种化疗药物的敏感性与亲本细胞SGC7901相比,mi R-23b-3p在胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达水平显著降低。上调mi R-23b-3p表达后,耐药细胞SGC7901/VCR对5-FU,VCR及CDDP的药物敏感性显著增强;相反,当下调SGC7901细胞中mi R-23b-3p的表达水平后其对上述三种药物的敏感性显著降低。此外,改变mi R-23b-3p的表达水平对胃癌细胞的增殖无显著影响。2.ATG12和HMGB2是mi R-23b-3p的直接靶基因经过生物信息学分析,初步将ATG12和HMGB2作为mi R-23b-3p的候选靶基因。进一步检测证实,ATG12和HMGB2在胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中表达显著升高。mi R-23b-3p通过结合ATG12和HMGB2的3’非翻译区降解其m RNA水平而直接负性调控靶基因的表达。下调ATG12和HMGB2表达后,胃癌耐药细胞对5-FU、VCR及CDDP的敏感性显著增加。此外,当下调HMGB2表达时,ATG12表达水平同时下调;而下调ATG12表达时,HMGB2表达水平无明显变化。3.胃癌多药耐药细胞的自噬水平显著增强TEM和CLSM均检测发现:胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中自噬体数目显著多于亲本细胞SGC7901。Western检测发现:自噬分子标志LC3II在SGC7901/VCR表达升高而p62表达降低;而在亲本细胞SGC7901中两者的表达则相反。4.抑制自噬可显著提高胃癌耐药细胞对多种化疗药物的敏感性通过si RNA技术下调ATG12或HMGB2表达后,胃癌耐药细胞的自噬水平较前显著下降。另外,在胃癌细胞中加入自噬抑制剂CQ后,与亲本细胞相比,LC3II在胃癌耐药细胞中的表达水平显著增高,与此同时胃癌耐药细胞对5-FU、VCR及CDDP的敏感性显著增加。5.mi R-23b-3p通过抑制ATG12和HMGB2介导的自噬进而调节胃癌细胞耐药转染mi RNA mimics上调胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中mi R-23b-3p的表达后,SGC7901/VCR自噬水平较前明显下降;而转染mi RNA inhibitor下调mi R-23b-3p表达后,亲本细胞SGC7901的自噬水平较前增强。此外,当应用低浓度5-Fu与细胞共培养后,胃腺癌细胞系BGC823和AGS中mi R-23b-3p的表达下降而ATG12、HMGB2以及LC3I/II的表达水平均较前明显升高。进一步在下调mi R-23b-3p表达基础上,下调SGC7901中ATG12和HMGB2表达水平可明显减弱mi R-23b-3p下调所介导的细胞耐药的作用。6.体内实验证实上调mi R-23b-3p的表达可显著提高胃癌耐药细胞对药物的敏感性q RT-PCR结果显示:与转染对照载体的细胞相比,稳定转染mi R-23b-3p的细胞中mi R-23b-3p的表达水平升高500多倍。稳转细胞系构建成功后行裸鼠皮下成瘤实验,结果证实:在未给予腹腔注射化疗药物之前,转染Lenti-mi R-23b-3p和Lenti-mi R-NC的细胞体内增殖趋势无显著差异。而给予裸鼠周期性腹腔注射药物后,转染Lenti-mi R-23b-3p的肿瘤体积较对照组显著减小。提示稳定表达mi R-23b-3p的SGC7901/VCR细胞在体内的药物敏感性依然显著高于转染对照空载体的细胞。7.mi R-23b-3p在胃癌化疗耐药患者组织中表达降低,其表达水平可作为预测胃癌患者预后的分子标志物化疗耐药的胃癌组织中ATG12和HMGB2的表达水平较化疗敏感组织显著增高而mi R-23b-3p的表达水平却显著降低。另外,原位杂交和组织芯片结果显示:mi R-23b-3p在临床胃癌患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、侵袭深度、淋巴结转移以及TNM分期等分组中表达无显著统计学差异,但其表达水平在远处器官转移分组中存在显著差异(p=0.005)。同时,生存分析发现,mi R-23b-3p表达水平较高的胃癌患者的总生存时间显著优于mi R-23b-3p低表达患者(Log-rank检验,P=0.0143)。8.初步证实mi R-23b-3p表达DNA受甲基化调控通过甲基化软件预测发现mi R-23b-3p转录起始位点上游存在多个Cp G岛。应用5-氮杂胞苷(5-Aza)去甲基化处理后,胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中mi R-23b-3p表达水平较前显著升高而SGC7901中mi R-23b-3p表达水平无明显变化。【结论】甲基化介导的mi R-23b-3p通过靶向ATG12和HMGB2来抑制自噬进而参与调节胃癌细胞多药耐药。mi R-23b-3p表达水平较高的胃癌患者其总生存时间显著优于mi R-23b-3p表达水平较低或阴性的患者。因此,mi R-23b-3p是一个新的与胃癌多药耐药相关的mi RNA,有望成为潜在的预测胃癌多药耐药的分子标志物和逆转胃癌耐药的治疗靶点。