结肠癌是最常见的消化道癌瘤之一，2002年全球结肠癌新病例占全部癌症的9.4%，死亡病例相当发病数的一半。世界范围内结肠癌发病日趋严重，死亡率攀升，2007年时由于患有结肠癌而导致死亡的患者多达63万人次，而新增发病人数亦超过百万。手术切除是结肠癌的首选疗法，但是临床治疗效果差,除手术治疗外往往配合放疗和化疗等治疗方法，但是放疗和化疗都有严重的副作用，这些都大大加深了肿瘤的治疗难度。本实验以反向的8肽胆囊收缩素为导向单元，以截短的绿脓杆菌外毒素为细胞毒活性单元制备靶向结肠癌的重组毒素药物，并优化该重组毒素的表达条件，优化其综合纯化条件，以及细胞水平的杀伤实验进而确定重组毒素的靶谱，为后期的动物实验和临床实验奠定基础，为日后结肠癌的非手术性治疗提供指导。随着对结肠癌发病机理机制研究，人们发现胆囊收缩素2型受体（CCK2R）的表达与结肠癌的发生、发展及浸润密切相关；研究表明，结肠癌组织和癌旁组织中的CCK2R表达率明显高于正常组织，因此CCK2R被认为是结肠癌的生物标记。本实验将反向8肽胆囊收缩素和截短的绿脓杆菌外毒素运用基因工程的方法连接，制备与CCK2R受体特异性结合的免疫毒素。在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中表达重组毒素rCCK8PE38,该重组毒素rCCK8PE38对结肠癌细胞系HCT-8高度敏感有杀伤活性， Western Blots实验证明rCCK8PE38可被PE38抗体识别。重组毒素rCCK8PE38三角瓶扩大培养后，表达条件无法放大。对此，我们设计实验分别优化该重组毒素三角瓶扩大培养后的最佳诱导时机、最佳诱导剂量、最佳诱导温度以及最佳培养基，最终获得了三角瓶扩大培养后的培养条件：按照1:100比例接种于三角瓶内的SOB液体培养基中，37℃恒温摇床振荡180rpm培养至1.5h时，加入终浓度为1.2mM IPTG诱导，28℃恒温培养6h。PE类重组毒素的纯化历来都是实验中的难点，传统的方法条件苛刻且操作复杂。本实验以实验室特有的亲和层析柱3B9为核心，结合硫酸铵沉淀法、疏水层析法、离子交换层析法等多种纯化策略，最终获得纯度约91%的纯体rCCK8PE38蛋白。在细胞水平上，对结肠癌细胞系HCT-8、SW480、HCT-116、HT-29；大肠癌细胞系SW116；胃癌细胞系MKN-45、MKN-1、BGC-823、SGC-790、MGC-8031；胰腺癌细胞系PANC-1等近40种癌细胞系和部分正常组织细胞进行体外杀伤实验，从而初步确立了该重组毒素的结肠癌靶向。同时，测定该重组毒素对以上细胞的IC50值；进行免疫荧光实验和受体竞争实验。以上实验结果表明，重组毒素rCCK8PE38可以特异性杀伤结肠癌细胞，对部分大肠癌细胞和胃癌细胞敏感，对其它癌细胞和正常组织细胞无明显毒性。一系列的实验结果表明，重组毒素rCCK8PE38靶向性良好，对非靶向细胞无明显毒性，为结肠癌的非手术治疗和配合放疗和化疗的综合治疗提供了新的思路。