论文部分内容阅读
背景:小肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是指临床上多种疾病状态导致的一种常见的病理性损伤过程,可导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),损伤组织器官不只局限于小肠,严重时可引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡。在I/R过程中,凋亡起着必不可少的作用。新近研究表明,肿瘤坏死因子相关受体因子2(Tumor necrosis factor receptor–associated factor 2,TRAF2)作为一种调节蛋白可明显抑制因氧化应激及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α刺激诱导的细胞凋亡。进一步研究表明,这一生理过程可由蛋白激酶Cζ(protein kinase Cζ,PKCζ)特异性磷酸化TRAF2丝氨酸55位点(Ser55)而激动。此外,TRAF2在心肌缺血再灌注损伤中可发挥保护作用已得到证实。然而,小肠I/R损伤过程是否涉及到PKCζ/TRAF2信号通路的参与国内外尚未见相关报道。Caco-2细胞在结构及功能上均类似于小肠上皮细胞,是一种来源于高分化的人结肠腺癌细胞。因为其理化性质与小肠上皮细胞相似,常被用于有关药物吸收及药物肠道代谢的体外实验研究中。目的:探讨PKCζ介导的TRAF2蛋白Ser55位点磷酸化激活在小肠I/R中的作用,阐明应用PKCζ激活剂卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)预处理能否通过影响TRAF2蛋白Ser55位点的特异性磷酸化进而对小肠I/R发挥保护作用。方法:1、动物实验40只健康成年雄性C57BL/6小鼠随机分为以下5组(每组n=8):假手术组(Sham组)、假手术给激动剂组(Sham+PC组)、模型组(I/R组)、模型给激动剂及抑制剂金硫丁二钠(aurothiomalate,ATM)组(I/R+PC+ATM组)。采用微型无创小鼠动脉夹夹闭各模型组小鼠肠系膜上动脉45min而造成缺血,分别在1h、2h或4h后取出动脉夹以构建肠缺血再灌注模型;针对假手术组中的所有小鼠肠系膜上动脉均仅施行游离但不夹闭处理;于手术前4h每间隔1小时采用灌胃的方式连续给予激动剂处理组小鼠适当浓度(0.3mM)的PC(0.2ml/h);在术前连续7天(每天一次)即采取腹腔注射的方式给予所有抑制剂处理组小鼠相应剂量的ATM(60mg/kg/d)。采用相同给药方式(灌胃或腹腔注射)予以未给药预处理组小鼠同等剂量的生理盐水。各再灌注时间点(1h、2h或4h)结束后,依次再次打开腹腔解剖游离并剪取适当长度各小鼠小肠组织置于适当条件下保存备用,小肠上皮细胞凋亡采用TUNEL法检测分析,小肠病理损伤采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察并进行病理学评分,小肠相关组织蛋白,包括PKCζ、PKCλ、磷酸化PKCζ(p-PKCζ)、TRAF2、磷酸化TRAF2-Ser55/11(p-TRAF2-Ser55/11)、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白水平采取Western-blot方法进行检测。2、细胞实验Caco-2细胞随机分为两组:空白对照组(Control)及模型组(hypoxia/reoxygenation,H/R)。H/R模型构建:首先将生长状态良好的Caco-2细胞制备成单细胞悬液,调整至合适的细胞浓度(1×10~6个/ml),再于6孔板的每孔中加入100μl处于混匀状态下的单细胞悬液及含10%胎牛血清成分的DMEM细胞培养基1400μl,经充分吹打混匀后,将细胞放入常氧(5%CO2)培养箱中培养,24小时后镜下观察细胞生长及贴壁情况,当培养至细胞融合达80%时弃除培养基,再用D-hanks缓冲液(提前置于37℃水浴锅中预热)反复清洗细胞两次,然后加入的1500μl DMEM细胞培养基(不含胎牛血清),将细胞至于缺氧(1%O2,94%N2,5%CO2)条件下培养12小时(缺氧),缺氧培养完成后,细胞转移至常氧(5%CO2)培养箱中继续培养6小时(复氧),复氧培养完成后进行免疫荧光及免疫共沉淀实验。结果:1、与Sham组相比,I/R组表现如下:HE染色结果提示小肠细胞呈明显水肿状态,小肠黏膜及黏膜下间隙伴有严重出血,小肠绒毛排列紊乱甚至断裂;Western-blot结果提示PKCζ蛋白表达水平显著升高且在再灌注2h时表达量达最高,而PKCλ无明显变化趋势;小肠组织TRAF2总蛋白水平无变化趋势,而p-TRAF2-Ser55及p-TRAF2-Ser11蛋白表达水平明显升高;Bcl-2蛋白(抑制凋亡蛋白)表达水平明显降低而cleaved caspase-3蛋白(促凋亡蛋白)表达水平明显升高;TUNEL检测结果提示小肠上皮凋亡细胞数目显著增加。2、与Control组相比,H/R组:TRAF2蛋白向细胞膜聚集,并于PKCζ蛋白结合。3、与I/R组相比,I/R+PC组:小肠组织病理损伤明显缓解;小肠组织PKCζ蛋白表达水平明显升高;TRAF2总蛋白及p-TRAF2-Ser11蛋白表达水平无变化趋势,而p-TRAF2-Ser55蛋白表达水平明显升高;Bcl-2蛋白表达水平显著升高而cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低;小肠组织TUNEL凋亡检测显示肠上皮凋亡细胞数目明显降低。4、与I/R+PC组相比,I/R+PC+ATM组:小肠组织病理损伤显著加重;小肠组织PKCζ蛋白表达水平明显下降;TRAF2总蛋白及p-TRAF2-Ser11蛋白表达水平无变化趋势,而p-TRAF2-Ser55蛋白表达水平明显降低;Bcl-2蛋白表达水平显著降低而cleaved caspase-3表达水平显著升高;小肠组织TUNEL凋亡检测显示肠上皮凋亡细胞数目明显增加。结论:1、PKCζ蛋白表达水平及其活性在小肠I/R模型中显著升高且进行细胞膜转位,进而特异性磷酸化TRAF2 Ser55位点,从而通过减轻细胞凋亡而缓解小肠I/R损伤;2、Caco-2细胞H/R后可介导TRAF2蛋白向细胞膜聚集,并与细胞膜部分的PKCζ蛋白结合,从而使TRAF2 Ser55位点磷酸化而发挥其生物学功能;3、PC可以增加小肠组织中PKCζ表达,从而进一步增加p-TRAF2-Ser55表达,降低肠上皮细胞凋亡从而减轻小肠I/R损伤,而ATM可以抑制PKCζ表达,导致肠上皮细胞过多凋亡从而加重小肠I/R损伤。