论文部分内容阅读
目的:肝细胞癌( hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,预后差,而且手术治疗后复发率较高,但是关于肝细胞癌发生、发展的确切分子机制还不清楚,因此研究肝细胞癌的发生、发展机理以及探讨新的治疗措施具有极其重要的临床意义。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor ,PPARs)是一类配体依赖的序列特异的核转录因子,因其具有被过氧化物酶体增殖物激活的特性,故而得名。迄今为止,已证实在脊椎动物中存在PPARα、PPARβ(或δ)、PPARγ这3种亚型,它们在结构、功能及组织分布上均有差异。PPARγ的生物学功能复杂多样,包括调控脂肪和糖代谢,脂肪细胞终末分化;控制单核细胞分化成熟,诱导巨噬细胞凋亡,抑制炎症反应;诱导肿瘤细胞分化和凋亡,抑制肿瘤血管生成;抗肝纤维化作用;抗动脉粥样硬化,降血脂和降血压;改善心功能衰竭和参与心室重构等。最新研究证实,PPARγ受体在多种肿瘤组织及细胞如大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌及肝癌中过度表达,与癌细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤生成有关。胰岛敏剂噻唑烷二酮类化合物(thiazolidinedionesTZDs),如罗格列酮(ciglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、环格列酮(ciglitazone)等,是PPARγ受体人工合成配体,这类药增强机体对胰岛素的敏感性并具有降低血糖的作用,临床上主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗。最近研究认为该类药物可通过激活PPARγ受体调控肿瘤细生长、促进肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成等。细胞凋亡是细胞生命周期中的重要组成部分,是有机体调控机体发育,维持内环境稳定的重要环节,是一种由内在基因编码调节,通过主动的生化过程,使细胞自杀死亡的现象,也就是说它是基因严格控制的细胞自主性死亡过程。目前认为与凋亡调控有关的基因有三类:抑制凋亡的基因﹑促进凋亡的基因和凋亡过程中起协助作用的基因。p27kip1作为近年来新发现的负性细胞周期调节蛋白,属于CDKI中Cip/kip家族。p27kip1主要作用是通过在G1期对cyclinE和CDK2结合的抑制,阻止细胞周期由G1期进展到S期,从而导致细胞周期停滞,使细胞发生肥大或凋亡。细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2 Skp2)是一种新发现的癌基因,Skp2是泛素连接酶E3结合磷酸化的p27kip1识别蛋白质,参与p27kip1的泛素化降解。Skp2的主要作用是促进细胞通过转换关卡的作用,有促进细胞周期的作用,从而促进细胞增殖。近年揭示Skp2在多种肿瘤中过度表达,但其对肿瘤的作用还未完全阐明。本研究拟检测肝癌细胞系中PPARγmRNA的表达及不同浓度罗格列酮对SMMC-7721细胞周期及凋亡率的影响,并检测与细胞周期调控相关的细胞因子p27kip1及Skp2的变化,从而探讨罗格列酮诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡及对细胞周期调控的可能机制。方法:对人肝细胞癌细胞株SMMC-7721细胞进行常规培养。采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,检测SMMC-7721细胞PPARγmRNA表达的变化,以?-actin作为内参照标准,并对扩增产物进行凝胶扫描;罗格列酮分别取0、0.1、1、10、100μmol/L 5个浓度组,其中10μmol/L浓度组取24h、48h、72h三个作用时间点培养细胞,采用FCM检测不同时间点、不同浓度罗格列酮对肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期和凋亡率的影响;以Western- blot方法检测不同时间点、不同浓度罗格列酮对SMMC-7721 p27kip1及Skp2蛋白表达的变化,并进行相对定量分析。结果:1 RT-PCR检测结果显示SMMC-7721中存在PPARγmRNA表达。2 FCM结果显示,罗格列酮使SMMC-7721细胞的G0/G1期比例显著升高( P<0.05),S期比例轻度降低( P<0.05),G2/M期明显降低(P<0.05),并且呈时间依赖性和剂量依赖性。同时罗格列酮对SMMC-7721细胞引起了显著的细胞凋亡,由于药物浓度和作用时间不同,细胞的凋亡率范围从5.15%～17.36%;但低浓度罗格列酮(0.1μmol/L)促进肝癌细胞凋亡作用不明显(P>0.05),但随着药物浓度的增加,罗格列酮的促凋亡作用明显增加并且呈时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05)。3 Westen blot结果显示罗格列酮能明显降低Skp2蛋白的表达,且抑制作用呈明显时间及剂量依赖性(P<0.05)。罗格列酮使SMMC-7721细胞p27kip1蛋白表达量明显升高,并且呈时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05)。结论:1人肝癌细胞系SMMC-7721中存在PPARγmRNA表达,位于360 bp处。2罗格列酮使SMMC-7721细胞的G0/G1期比例显著升高,S期比例轻度降低,G2/M期明显降低,使肝癌细胞停止于G0/G1期,同时罗格列酮对SMMC-7721细胞引起了显著的细胞凋亡,并且呈时间依赖性和剂量依赖性。3罗格列酮能时间及剂量依赖性降低Skp2蛋白及增加p27kip1蛋白的表达,表明罗格列酮可能通过上调p27kip1和下调Skp2的表达改变细胞周期和诱导细胞凋亡。