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七鳃鳗是现存海洋生物中最原始的无颌类脊椎动物之一,身体结构及生活习性高度保守,距今有3.5亿年的历史。本论文利用分子生物学技术和生物信息学方法首次从日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞中获得了α-天冬氨酰二肽酶(α-aspartyl dipeptidase,AAD)和棕榈酰蛋白硫酯酶1(palmitoyl protein thioesterase1,PPT1)的同源基因,通过基因克隆、重组表达及生物信息学方法对基因进行分析预测,为更好了解蛋白特性及活性奠定基础。 AAD能够特异性水解N末端为天冬氨酰的二肽,可用于合成现今世界上的两大甜味剂阿力甜和阿斯巴甜。目前为止AAD在有颌类脊椎动物和细菌中已有所研究,但其生物活性在日本七鳃鳗这一古老的无颌类脊椎动物中还没有研究。本论文是首次从日本七鳃鳗中克隆并鉴定了AAD基因。将克隆得到的基因连接到带有组氨酸标签的表达载体pET-22b上,转化至表达菌Escherichia coli BL21(DE3)中,用1 mM IPTG诱导表达,并筛选重组蛋白表达的最适条件,SDS-PAGE分析结果。Lj-AAD ORF区为717 bp,编码238个氨基酸,理论分子量为26.5 kDa,等电点为5.83。不含信号肽。表达后蛋白以包涵体形式存在。对其进行变性和复性,并对酶活性进行检测。检测酶蛋白对温度和pH的稳定性等酶学特性。特别的是Lj-AAD在低温条件下活性显著增加,能够有效提高底物利用率。 PPT1能够水解棕榈酰蛋白的硫酯键,可通过溶酶体降解途径脱去棕榈酰化蛋白的酰基。目前只有PPT1和酰基蛋白硫酯酶1(acyl protein thioesterase1,APT1)两种酶被认为是能够去除棕榈酰蛋白的棕榈化修饰。本论文首次从日本七鳃鳗中克隆得到PPT1基因,将克隆得到的基因连接到带有组氨酸标签的表达载体pET-22b上,转化至表达菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达,并筛选重组蛋白表达的最适条件,SDS-PAGE分析结果。日本七鳃鳗PPT1基因ORF区为972 bp,编码323个氨基酸,理论分子量为36.6 kDa,等电点为5.91。表达后蛋白存在于包涵体和上清中。