几丁质(Chitin)是由N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine, GlcNAc)经β-1,4糖苷键连接而成的寡聚物,是自然界中广泛存在的天然有机化合物之一,其数量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于真菌及藻类的细胞壁、无脊椎动物的外骨骼及表皮。前人的研究证明,几丁质是昆虫表皮和围食膜(Peritrophic membrane,PM)的重要组成成分之一,昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质,几丁质代谢随着昆虫不同生长发育阶段而变化,因此,几丁质在昆虫的正常生长发育过程中有着至关重要的。家蚕(Bombyx mori)既是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的典型代表。家蚕围食膜已知的主要组分有几丁质、蛋白质,围食膜蛋白质对维持着围食膜的结构的完整性,蛋白质多糖的疏水性则有助于围食膜几丁质微纤维网状结构的形成,并维持其强度。围食膜作为家蚕体内防御病原微生物入侵的第一道防线,通过降解合成的几丁质或破坏蛋白与几丁质的结合,即可以抑制围食膜的形成以及昆虫的生长发育等,达到防治害虫的目的,具有极大的发展潜力,同时也是国内外研究的热点。在昆虫中,几丁质去乙酰化酶(Chitin Deacetylase, CDA)不仅是围食膜重要结构蛋白质之一,也可以对几丁质进行修饰,因此,可作为破坏围食膜结构的新靶标。本文通过蛋白质组学技术对家蚕围食膜进行全蛋白质组分析,筛选家蚕BmCDA7蛋白质,对家蚕CDAs家族成员进行系统分析。利用原核表达的重组蛋白质制备多克隆抗体,分析其在组织和时期中的表达方式。通过真核表达得到具有活性的家蚕BmCDA7蛋白,首次比较准确的测定昆虫CDAs的活性,然后对家蚕中肠特异BmCDA7基因进行转基因增量表达和干涉,检测中肠围食膜的变化,研究家蚕CDA基因与几丁质的关系,进一步阐述家蚕BmCDA7基因的功能。主要研究结果如下：1.家蚕围食膜的结构及其蛋白质组成家蚕围食膜包裹着食物,为无色、透明的管状结构,类似于I型围食膜。解剖过程中发现围食膜几乎布满整个中肠,并且富有弹性。从家蚕横切面可以清楚的看到有围食膜位于食物和中肠之间。通过几丁质染色,证明家蚕围食膜和其他昆虫的结构也是一样,都是由几丁质丝组成的网状结构,围食膜的这种结构保证了其对中肠的防护功能。对家蚕围食膜进行扫描电镜观察,从家蚕围食膜的外表面可以发现家蚕围食膜至少有两层,内表面绝大部分是光滑致密,具有明显的褶皱,该结构不仅有利于食物的吸收,而且对中肠的保护作用。我们对家蚕五龄第3天围食膜的总蛋白质进行shotgun分析,最后成功鉴定305个可信度较高的蛋白质。这些蛋白质的分子量大部分分布在8.02kDa和788.52kDa之间,除了两个蛋白质例外：BGIBMGA010471-PA的分子量大小为1538.87kDa, BGIBMGA006856-PA的分子量甚至达到2002.29kDa；但是小于100kDa的蛋白质还是占大多数的,占79.34%。家蚕围食膜蛋白质极酸蛋白质和极碱蛋白质的等电点分别为3.39和12.91。我们同时构建了围食膜的双向电泳图谱,检测到较为明显的蛋白点在60多个,这些蛋白质点主要分布在分子量10-60kDa,等电点pI4-9的范围内。通过MALDI-TOF MS鉴定,有12个蛋白质点得到了鉴定(均包含于shotgun数据中)。通过信息分析和功能注释,我们找到了两个较为重要的围食膜结构蛋白质：Chitin deacetylase(几丁质去乙酰化酶)、Peritrophic membrane chitin binding protein2(围食膜几丁质结合蛋白质2)。利用GO分类对鉴定到的蛋白质进行功能分析：305个蛋白质中有216个蛋白质获得至少一个GO号,这些蛋白质被分为三大类,主要参与细胞成分、分子功能和生物过程。对这些蛋白质进行KEGG pathway分析,他们主要分为代谢(metabolism),遗传信息处理(genetic information processing),环境信息处理(environmental information processing),细胞过程(cellular processes),有机体系统(organismal systems)和人类疾病(human diseases)五大类。它们具体主要参与蛋白吸收和消化、碳水化合物代谢、解毒代谢及免疫反应过程等。其中消化系统(digestive system)在有机体系统中占有比例最高,而参与免疫系统(immune system)的有5个pathway。这正好解释围食膜不仅帮助中肠进行酶解食物等消化吸收作用,还可以参与了家蚕的免疫防御过程,对中肠起保护作用。我们比较感兴趣的正是这些与免疫相关的蛋白质,比如,Cadherin membrane protein、Aminopeptidase N、Alkaline phosphatase、Serine protease、Lipase等。通过芯片数据分析,这些蛋白质都是在中肠高量特异性的表达。通过RT-PCR对具有几丁质结合蛋白质和丝氨酸蛋白酶抑制剂对应的基因进行表达检测,进一步确认它们都是中肠特异的基因,由此,我们推测这些蛋白质应该都是围食膜的蛋白质。2.家蚕BmCDA7基因的全长克隆及序列分析结合家蚕基因9×数据,利用Race技术我们获得了BmCDA7基因全长cDNA序列1357bp(含ployA)大小,该序列具有一个1140bp大小的编码区,27bp大小的5’UTR和190bp大小的3’UTR。该基因定位于28号染色体,编码379个氨基酸,前面16个氨基酸为信号肽,分子量为41.26kDa,等电点为5.12,富含15个半胱氨酸,具有一个几丁质去乙酰化酶结构域。在第168个氨基酸可能发生N连接-糖基化,在第209,215个氨基酸可能发生O连接-糖基化。从家蚕基因组中鉴别出了8个家蚕CDAs基因,并把它们命名为BmCDA1～BmCDA8,它们都具有一个几丁质去乙酰化酶功能域及五个典型的motif。所有CDAs成员都具有信号肽和糖基化位点,其中BmCDA2和BmCDA5都具有两种拼接形式,其中只有BmCDA3和BmCDA4没有EST证据。系统发生分析结果表明,昆虫CDAs分为5类群,BmCDA7属于V群,仅仅只含有几丁质去乙酰化酶结构域。结合家蚕全基因组的表达谱芯片和RT-PCR的结果,发现BmCDA7基因在胚胎第9天后开始表达,一直持续到五龄第7天,以后基本不表达。这个时期正好是家蚕中肠从形成到凋亡的过程。另外BmCDA7基因在每龄起蚕都比眠蚕表达量有所提高,这个正是家蚕围食膜更替的时间点,暗示着该基因可能跟围食膜的更新有关。3.家蚕BmCDA7基因的原核表达及组织定位将BmCDA7基因的编码区亚克隆到p28表达载体,构建成p28-BmCDA7原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,以加入终浓度为0.2mM的IPTG,37℃培养4h为诱导条件,与对照相比,在35～45kDa之间位置处有特异条带,与目的蛋白预测分子质量大小相符合,说明均BmCDA7重组蛋白获得了表达。经蛋白组分鉴定发现,BmCDA7重组蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌表达菌株表达。利用Ni柱结合切胶的方法纯化原核表达的BmCDA7重组蛋白,并成功制备BmCDA7重组蛋白的多克隆抗体。Western blotting检测家蚕组织中BmCDA7蛋白质的分布情况,结果表明BmCDA7蛋白质在家蚕5龄3天的中肠和围食膜中都能够检测到,在前肠、后肠和除去消化道的整蚕都未检测到,表明BmCDA7蛋白质在mRNA水平和蛋白质水平上都有表达,并且在·mRNA水平和蛋白质水平的表达情况相一致。证实BmCDA7蛋白质在中肠和围食膜是特异的蛋白质。4.家蚕BmCDA7基因的真核表达及其蛋白酶活测定将BmCDA7基因亚克隆到pPIC9K真核表达载体,线性化质粒DNA后电转化GS115菌株上,通过转化子筛选获得整合入酵母染色体上的重组酵母重组质粒,在毕赤酵母中进行真核表达。Western blotting的结果进一步确实目的蛋白质得到了表达。诱导96h的上清液经过硫酸钱粗纯化后,再用PEG20,000进行浓缩。参考前人对CDA酶活的测定方法对粗纯化BmCDA7重组蛋白质样品进行酶活测定。我们测得粗纯化BmCDA7重组蛋白质样品的酶活力为1.85U/mL。5.家蚕BmCDA7基因的功能研究为了获得可遗传的转录后基因增量表达或基因沉默,我们构建了两个转基因载体：转基因增量表达载体pBac[P2-BmCDA7-SV40,3×P3-EGFP-SV40],转基因干涉表达载体pBac[P2-BmCDA7S-I-BmCDA7A-SV40,3×P3-EGFP]。显微注射非制育蚕卵,并在G1代进行荧光检测,均获得了转基因阳性个体。利用反向PCR技术,对转基因系统的插入位点进行鉴定,结果显示：转基因增量和干涉表达系统的插入位点分别位于第10号染色体的nscaf2859上以及第15号染色体的nscaf2888上。分析两个转基因系统中的围食膜通透性,结果发现在这两个转基因品系的围食膜内腔中蓝色葡聚糖的含量都要比对照多,说明了这两个转基因品系的围食膜通透性都比对照有所提高。通过围食膜超微结构的观察,我们发现这两个转基因品系中的围食膜上的几丁质都发生了明显的变化,都有所减少或变小,其排列也不同于对照。可能是由于在增量表达转基因系中BmCDA7蛋白提高了,几丁质被过度修饰了,从而影响了通透性；而干涉了该基因后可能是由几丁质合成后没有该酶的修饰,发生了几丁质畸形。进一步对围食膜的几丁质含量进行了测定,发现这两个转基因品系的围食膜几丁质的含量都比降低。这些变化可能就是引起这两个转基因品系的围食膜通透性提高的原因。综上,我们推测BmCDA7对几丁质的修饰作用在围食膜几丁质的形成排列起着重要的作用。