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赤藓糖醇是一种四碳多元醇,在食品生产中常用作低热量甜味剂。作为美国食品药品监督管理局认定的GRAS菌,亚罗解脂酵母是生产赤藓糖醇的首选菌株。由于该菌是好氧发酵,产热量较多,但发酵温度一般不超过30°C,因此夏季面临降温难题,导致停产、染菌倒罐等问题,成为推高生产成本的重要因素。另外,亚罗解脂酵母有多个自交系,染色体结构差异很大,代谢改造困难。本课题以提高亚罗解脂酵母热耐受性、提高发酵产量为目标,通过适应性进化获得耐热菌株,并经转录组分析挖掘到耐热的关键途径基因;对野生型菌株进行全基因组测序,并建立分子操作基础,通过耐热关键途径基因的分子改造验证,揭示了菌株耐热机理;基于转录因子Ery D构建响应赤藓糖醇的生物传感器,用作高产菌株的高通量筛选工具;通过建立突变体文库、开展高通量筛选、代谢工程改造组合策略,获得赤藓糖醇耐热高产菌株。主要结果如下:（1）通过适应性进化,筛选获得了可耐受发酵温度35°C的菌株BBE-18,但发酵周期延长。基于转录组学数据,从GO功能、KEGG途径以及中心碳代谢途径、氨基酸合成代谢途径、麦角固醇和海藻糖合成途径等多维度进行分析,阐述了BBE-18的耐热机制。这些途径主要关系到细胞物质和能量代谢,其代谢受阻是热胁迫抑制菌体生长的主要原因。硫胺素途径中,焦磷酸硫胺素是上述相关途径多个关键基因的辅因子,且胞内硫胺素含量直接影响ATP合成酶的蛋白丰度,因此挖掘硫胺素途径耐热相关基因有利于解决物质和能量代谢受阻问题。同时发现,酸性磷酸酶对于提高亚罗解脂酵母的热耐受性也具有一定作用。另外,丝状生长信号通路作为一种觅食反应,有利于菌体抵御胞内物质和能量不足。从上述三个方面入手,本研究共挖掘到12个耐热相关基因:YALI0E32681g、YALI0E35222g、YALI0A12573g、YALI0F26521g、YALI0E00110g、YALI0F25773g、YALI0C14938g、YALI0A08800g、YALI0D01331g、YALI0E23430g、YALI0C15609g、YALI0E33803g。（2）通过全基因组测序获得野生型菌株BBE-17的基因组序列,并通过共线性分析发现其基因组发生严重结构变异,为分子操作提供信息。在羟基脲的辅助下,敲除BBE-17中非同源末端连接关键基因KU70,为后续分子操作奠定基础。以5-氟乳清酸为筛选标记,敲除URA3,构建尿嘧啶营养缺陷型菌株。接下来,将转录组挖掘的12个耐热相关基因,在模式菌PO1f中以质粒p YLXP’为载体游离表达,除YALI0C14938g外,其他单基因表达均可以提高PO1f的热耐受性。将效果较好的YALI0E23430g、YALI0A08800g、YALI0E35222g组合表达,其中YALI0A08800g、YALI0E35222g串联组合表达耐热效果最为突出,在比正常培养温度（30°C）提高3°C的条件下,稳定期菌体OD为对照菌株的2.18倍。进一步对硫胺素途径进行优化,组合表达YALI0E32681g、YALI0A12573g、YALI0F26521g效果最好,33°C下生长稳定期菌体OD为对照菌株的3.70倍。将优选方案在野生菌BBE-17△KU70△URA3中表达,构建菌株BBE-17T,33°C下生长稳定期菌体OD为对照菌株BBE-17的2.5倍。（3）以来自布鲁氏杆菌（Brucella abortus）的转录调控因子Ery D为传感器,在骨架质粒p ET-22b（+）中插入e GFP报告基因,转化大肠杆菌E.coli BL21,构建以赤藓糖醇为效应物的生物传感器指示菌（SMB）。分析发现,Ery D的功能结构为四聚体,在赤藓糖醇的作用下,分解为两个二聚体,并从靶向位点脱落,暴露转录起始位点,启动基因转录。胞外热力学分析表明Ery D与DNA结合序列（DBS）及赤藓糖醇都有明显的亲和力,其结合主要受范德华力或氢键的影响。构建SMB时发现,在大肠杆菌中以含有DBS序列的启动子p DBS表达e GFP,荧光显微镜下无法观测到荧光。基于此,在质粒p ET-22b（+）中,用DBS和Ery D分别重组替换Lac O和Lac I。然后从DBS上游逐渐截短,当截短至104 bp时,构建成功。对SMB特性进行表征:在赤藓糖醇环境中,其响应精度为250-500 m M;在50-140 g·L-1葡萄糖影响下,其对赤藓糖醇的响应精度为5-250 m M。SMB的成功构建为后续高通量筛选奠定方法基础。（4）以耐热菌BBE-18为研究对象,采用复合诱变构建突变体文库。优化孔板发酵条件,使发酵液中赤藓糖醇含量在SMB响应范围内。然后,利用前面建立的高通量方法对突变体文库进行筛选,获得4株副产物比BBE-18降低84%的耐热高产菌株,摇瓶中相同发酵条件下,其中yli UA8的产量达到103 g·L-1,比原始菌株BBE-18的产量提高了1.4倍;在3-L发酵罐中,通过补料发酵,yli UA8的产量达到148 g·L-1。为防止菌体对赤藓糖醇的消耗,分别敲除EYK1、EYD1,发现敲除EYK1效果不明显,敲除EYD1则可以有效防止赤藓糖醇降解,且副产物消失。采用诱导型启动子p EYK1过表达糖异生途径关键基因FBP,减少碳代谢流下移,推动代谢流转向戊糖磷酸途径,然而赤藓糖醇产量达到10 g·L-1后,OD出现快速下降,无法提高赤藓糖醇产量。采用诱导型强启动子p EDK1过表达TKL,拉动代谢流进入戊糖磷酸途径,菌体生长良好,补料发酵赤藓糖醇产量达206 g·L-1,比yli UA8产量提高了39%。