一.研究背景细胞程序性坏死是一种新近鉴定的细胞程序性死亡,具有明确的调控靶点、具体的调控机制和确切的生理和病理功能。细胞程序性坏死是一种可调控的细胞死亡方式,只是由于死亡细胞表现出细胞坏死的形态特征(如细胞器肿胀和细胞膜破裂等),因而被命名为细胞程序性坏死(programmed cell death,necroptosis)。已有研究表明,死亡配体、化疗药物、病原微生物(细菌和病毒)入侵等多种因素都能诱导细胞程序性坏死,从而决定了它具有广泛的生物学功能,在胚胎发育,缺血再灌注损伤和炎症等生理和病理过程中发挥重要调控作用。因此,鉴定调控细胞程序性坏死的新靶点并探讨其调控机制,可以为细胞程序性坏死相关疾病的药物研发及临床治疗提供理论指导与参考。FK506结合蛋白 12(FK506-bindingprotein 12,FKBP12)是一种分子量为12kD的亲免素家族蛋白,含有肽基-脯氨酰异构酶结构域,可以催化多肽或蛋白质脯氨酸残基中N端肽键的顺反构象变化,改变底物蛋白的活性。同时,FKBP12也可发挥分子伴侣和接头蛋白的作用,介导蛋白复合体的组装和活化。因此,FKBP12具有多种生物学功能,如调控基因转录和细胞内钙离子的浓度,阻断TGF-Smad通路的信号转导等。但是,目前并无相关研究发现FKBP12参与细胞程序性坏死的调控。二.研究目的本研究将鉴定FKBP12在细胞程序性坏死中的调控作用和机制,并探讨FKBP12在细胞程序性坏死相关疾病中的作用,从而鉴定调控细胞程序性坏死的新靶点,为细胞程序性坏死相关疾病的治疗提供参考。三.研究方法(1)通过透射电镜分析细胞死亡的形态特征、Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞死亡类型和比例,鉴定TNFα诱导的L929和HT22细胞死亡方式。(2)利用显微镜直接观察法、台盼蓝拒染法及流式细胞术测定PI染色阳性细胞比例的方法检测TNFα诱导的细胞程序性坏死。通过慢病毒介导的基因敲入和敲低技术,构建稳定过表达或敲低FKBP12的细胞系,并结合FKBP12配体药物,鉴定FKBP12对细胞程序性坏死的调控作用。(3)利用TNFα与CHX联合诱导的NIH/3T3细胞死亡模型,研究FKBP12敲低对细胞凋亡的影响。(4)利用免疫沉淀和Western blot技术检测RIPK1和RIPK3的相互结合,同时利用Duolink in situ PLA技术体系配合激光共聚焦显微镜观察对RIPK1与RIPK3结合形成坏死复合体进行验证。(5)利用NuPAGE(?)electrophoresis system技术体系和Duolink in situ PLA技术体系检测RIPK1、RIPK3及MLKL蛋白同源分子间的相互作用。(6)利用Real-time PCR或Western blot技术对FKBP12敲低或过表达效果进行验证,同时,Western blot也用于检测其他蛋白的表达或磷酸化水平变化,并配合细胞成份分离技术检测蛋白质的亚细胞定位。(7)通过小鼠尾静脉注射TNFα构建全身炎症反应综合征(systemic infalmattory response syndrome,SIRS)动物模型,通过监测小鼠的体温变化和生存率,判定SIRS的发病程度;利用HE染色检测小鼠肝脏和盲肠组织的损伤情况,评价SIRS作用的靶器官。(8)通过慢病毒介导的RNA干扰技术建立FKBP12敲低小鼠,或利用FKBP12配体化合物进行处理,检测FKBP12在TNFα诱导的全身炎症反应综合征中的调控作用和机制。四.研究结果(一)FKBP12是调控细胞程序性坏死的新靶点。(1)TNFα与Z-VAD联合诱导的L929和HT22细胞死亡具有经典的坏死样细胞的形态结构变化,表现为Annxin V-FITC/PI双阳性染色,且能被细胞程序性坏死的靶点抑制剂Necrostatin-1(Nec-1),GSK’872和Necrosalfonamide(NSA)所阻断,因而是经典的细胞程序性坏死。(2)FKBP12配体化合物及FKBP12敲低能够阻断TNFα单独或与其他化合物联合诱导的细胞程序性坏死,且在FKBP12敲低的细胞中恢复FKBP12的表达能够恢复L929细胞对TNFα诱导的细胞程序性坏死的敏感性,表明FKBP12是调控细胞程序性坏死的重要靶点。(二)FKBP12在TNFα诱导的细胞程序性坏死中的调控机制研究。(1)FKBP12敲低及FKBP12配体FK506能够阻断TNFα诱导的细胞程序性坏死,但是对TNFα诱导的mTOR信号通路的活化并没有影响,因此,FKBP12对细胞程序性坏死的调控与mTOR信号通路无关。(2)FKBP12敲低可以显著抑制TNFα与Z-VAD联合诱导RIPK1,RIPK3和MLKL磷酸化,及MLKL多聚体的形成和膜转移,表明FKBP12可通过调控RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路的活化,进而调控TNFα诱导的细胞程序性坏死。(3)FKBP12敲低可抑制RIPKl-RIPK3坏死复合体以及RIPK1,RIPK3同源多聚体的形成,而RIPK1与RIPK3之间形成的异源二聚体和同源多聚体都是促进RIPK1和RIPK3磷酸化的重要途径,因此,这可能是FKBP12调控RIPKl-RIPK3-MLKL信号通路活化的机制。(4)FKBP12通过调控RIPK1和RIPK3的表达,影响其磷酸化水平及后续坏死复合体的形成,并启动调控细胞程序性坏死的循环通路,从而实现对细胞程序性坏死的调控。(三)FKBP12在TNFα诱导的全身炎症反应综合征中的调控作用。(1)利用腹腔注射FKBP12 shRNA慢病毒浓缩液构建了FKBP12敲低小鼠,且通过检测SIRS模型的靶器官——盲肠组织中FKBP12的mRNA和蛋白水平验证了FKBP12的敲低效果,保证了FKBP12敲低小鼠在后续研究中的使用。(2)FKBP12敲低能够抑制TNFα注射导致的小鼠体温下降及死亡,同时,FK506和Rapamycin的给药处理与FKBP12敲低具有类似的效果,表明FKBP12敲低可以缓解TNFα诱导的SIRS发病程度,进一步表明FKBP12是调控SIRS的重要靶蛋白。(3)HE染色检测结果发现TNFα诱导的SIRS模型中,小鼠的肝脏组织没有明显的变化,但盲肠组织出现明显炎症损伤,而FKBP12敲低减轻了盲肠的损伤程度;同时FKBP12敲低可抑制盲肠组织中TNFα对RIPK1和RIPK3的活化,表明FKBP12是调控细胞程序性坏死的重要靶点。五.研究结论FKBP12是调控细胞程序性坏死的新靶点,能够通过调控RIPK1和RIPK3的表达及磷酸化来促进RIPK1/RIPK3异源二聚体及RIPK1和RIPK3同源多聚体的形成,进而促进RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路的活化,启动TNFα诱导的细胞程序性坏死。同时,FKBP12对细胞程序性坏死导致的全身炎症反应综合征也具有重要的调控作用,表明FKBP12在体内也可以调控细胞程序性坏死的发生。基于以上结果,我们认为FKBP12蛋白可能成为治疗SIRS等炎症性疾病的有效靶点,而FKBP12蛋白的配体药物可能应用于包括SIRS在内的多种细胞程序性坏死相关疾病的临床治疗。