论文部分内容阅读
目的(1)探讨大肠癌组织中STAT3表达,并研究STAT3表达与肿瘤血管生成的相关性。(2)观察STAT3基因沉默对大肠癌HT-29细胞的增殖能力及细胞周期变化的影响。(3)观察STAT3基因沉默对大肠癌HT-29细胞裸鼠皮下种植瘤生长的影响。(4)在裸鼠体内观察STAT3信号对肿瘤血管生成的影响,并初步探讨其作用机理。方法(1)取临床大肠癌石蜡标本,免疫组化检测STAT3、CD34的表达情况,通过CD34的表达情况计数MVD,应用统计学方法分析STAT3表达与MVD的相关性。(2)设计合成3对靶向STAT3基因的siRNA序列,通过筛选获得最佳siRNA序列,构建shRNA表达序列并连接到慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中,获得pRNAT-shSTAT3重组慢病毒质粒,经酶切和测序鉴定正确后,进行包装产生病毒液,测定其滴度。将包装获得的病毒液感染大肠癌HT-29细胞,筛选扩增获得阳性细胞株HT-29-shSTAT3。同法,用慢病毒空质粒包装后产生的病毒液感染大肠癌HT-29细胞,筛选获得阳性克隆细胞株HT-29-GFP。Real-time PCR和Western blot检测shRNA对STAT3基因的沉默效率,MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。(3)分别将HT-29、HT-29-GFP、HT-29-shSTAT3细胞注射入裸鼠皮下成瘤,定期测量各组肿瘤体积变化。(4) 30天后处死裸鼠,取各组瘤组织通过免疫组化检测STAT3和CD34的表达情况,并计数MVD。血管生成基因芯片检测肿瘤组织内血管生成和抑制因子的表达情况。结果(1)临床大肠癌组织中STAT3蛋白表达阳性率为63.6%,显著高于正常大肠组织;大肠癌组织中MVD为47.55±12.15,而正常大肠组织中MVD为11.67±1.08,两者相比具有显著差异(P<0.01);大肠癌组织中STAT3的表达和MVD与肿瘤的恶性程度、Duke’s分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。相关分析表明STAT3表达与MVD呈显著正相关(r=0.788)。(2)酶切鉴定和测序结果证实STAT3shRNA核苷酸序列插入正确,成功包装后产生病毒悬液的滴度为2×107TU/ml。病毒感染大肠癌HT-29细胞,经G418筛选获得稳定细胞株,Real-time PCR和Western blot分别显示HT-29-shSTAT3细胞STAT3 mRNA的表达和蛋白明显减弱,表达量分别为16.9±2.1%、18.8±2.4%(P<0.01)。MTT结果显示STAT3基因沉默后的大肠癌HT-29细胞生长明显减慢,G0/G1期细胞占68.73±2.88%,S期细胞占22.93±1.10%,与对照组相比差异显著(P<0.01)。(3)各组裸鼠在接种肿瘤细胞后均成瘤,至接种后第15天,HT-29-shSTAT3细胞接种组肿瘤体积明显小于HT-29和HT-29-GFP细胞接种组(P<0.05);至接种后第30天差异更为显著(P<0.01),肿瘤生长抑制率为57.46%。(4)取肿瘤组织行免疫组化检查,见HT-29和HT-29-GFP组肿瘤内有多量的微血管分布,MVD分别为28.73±5.11,27.60±4.27,两者无显著差异(P>0.05);而HT-29-shSTAT3组微血管明显减少,MVD为9.80±3.02,与前两组相比,差异显著(P<0.01)。(5)血管生成基因芯片结果提示在HT-29-shSTAT3裸鼠组大肠癌组织中,表达下调的基因有15条,上调的基因有7条。结论(1)临床大肠癌组织中存在STAT3的高表达,STAT3的表达可能在大肠癌的病程发展及转移过程中发挥重要的作用。大肠癌的发生过程中STAT3信号与肿瘤血管的生成密切相关。(2) STAT3信号通路对于大肠癌HT-29细胞生长起着重要的作用,沉默STAT3基因表达的大肠癌HT-29细胞生长速度明显减慢,细胞阻滞于G0/G1期。(3)抑制STAT3信号可以抑制大肠癌HT-29细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。(4)在大肠癌组织中,STAT3信号可以促进肿瘤血管生成。(5)在大肠癌肿瘤血管生成过程中,STAT3信号可能通过调控VEGF-A、MMP-2、ECGF1、EPHB4、IGF1、NRP1、NRP2、STAB1、TNF、VEGFR-1、BAI1的表达来促进新生血管的生成。